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GBT 18638-2021 流行性乙型脑炎诊断技术.pdf1小鼠（或乳鼠）盲传3代无发病症状，细胞盲传3代未见细胞病变，且经6.5所述方法检测阴 判定为JEV分离阴性
6.6.2对发病死亡小鼠（或乳鼠）和出现CPE的细胞培养液，经6.5所述方法检测阳性者，判 分离阳性。
JB/T 11388-2013 油田钻井泥浆转运设备技术规范7.1.1台式高速（12000r/min）离心机。 7.1.2 基因扩增仪。 7.1.3 稳压稳流电泳仪。 7.1.4 水平电泳槽。 7.1.5 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）。 7.1.6 成套可调移液器（量程范围0.5μL～1000μL)及匹配的吸头 7.1.7 带盖的塑料离心管。 7.1.8 无RNA酶的离心管与吸头。 7.1.9PCR管
台式高速（12000r/min）离心机。 7.1.2 基因扩增仪。 7.1.3 稳压稳流电泳仪。 7.1.4 水平电泳槽。 7.1.5 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）。 7.1.6 成套可调移液器（量程范围0.5μL～1000μL)及匹配的吸头。 7.1.7 带盖的塑料离心管。 7.1.8 无RNA酶的离心管与吸头。 7.1.9PCR管
7.2.3.1电泳缓冲液：50XTAE贮存液（见附录A），临用时加蒸馏水配成1XTAE缓冲液。 7.2.3.2琼脂糖：国产或进口的低熔点琼脂糖，制胶时用， 7.2.3.3电泳加样缓冲液：含溴酚蓝0.25g、丙三醇（甘油）30mL、双蒸水70mL。 7.2.3.4DNA分子质量标准：分子大小范围100bp~1000bp，100bp梯度
.3.1在生物安全柜中，将采集到的病料组织（如脑、死胎、睾丸）置乳钵中（冰上操作），剪碎，加灭直
7.4.1总RNA提取
7.4.1.1在核酸提取室操作。RNA提取使用变性液手工提取，也可使用等效的商品化试剂盒。 7.4.1.2取n个灭菌的1.5mL无RNA酶离心管，其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照，对每 个离心管进行编号 7.4.1.3每管加入600μL变性液，再分别加人被检样品、阳性对照及阴性对照各200μL，颠倒10次混 匀，最后加人200uL酚氯仿抽提液，涡旋振荡5s，4℃条件下12000r/min离心15min。 7.4.1.4将上层透明液体（约400uL)转移到一个新的无RNA酶离心管中，加入等体积预冷的异丙醇， 每个离心管对应编号。 7.4.1.512000r/min离心15min，弃去上清液，沿管壁缓缓加入0.8mL75%乙醇，颠倒3次～6次混 习，12000r/min离心10min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾十或用移液器移去 残液。 7.4.1.6加人20μLDEPC水，轻轻混匀，溶解RNA。提取的RNA应尽快进行反转录扩增或放置于 70℃冰箱保存。 7.4.1.7提取过程中要注意交叉污染，移液过程每份样品都需更换吸头，不同样品离心管倒扣在吸水纸 上不同位置。
7.4.2.1反应体系配制
扩增体系配制如下： 10X一步RNAPCR缓冲液 MgCl2(25mmol/L) dNTP(各10mmol/L) RNase抑制剂（40U/μL) AMV(5 U/μL) 优化的AMVTaq(5U/μL) 下游引物（50pmol/μL） 上游引物（50pmol/μL） DEPC水
7.4.2.2反应程序设置
扩增程序设置如下： a)50℃,30min; b)94 ℃,5min; c）94℃，40s；55℃，30s；72℃，30s；30次循环；
d) 72 C.7 min
7.4.3扩增产物电泳检
7.4.3.1琼脂糖凝胶板的制备：称取1g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液中，加热融化后加5uL (10mg/mL)溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选 用适宜的梳子，待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放人电泳槽中，加1XTAE缓冲液淹没 胶面。 7.4.3.2加样：取6μL～8μLPCR扩增产物和2μL～3μL加样缓冲液混匀后加人一个加样孔。每次 电泳至少加1孔阳性样品的扩增产物作为对照。同时加DNAMarker作分子量大小对照 7.4.3.3电泳：在电压80V~100V或电流25mA~40mA条件下电泳10min。 7.4.3.4凝胶成像：电泳结束后，取出凝胶板，置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。阳性样品PCR产物 条带大小应为430bp，与阳性对照一致，同时阴性对照无条带。 7.4.3.5DNA测序分析：将阳性样品PCR产物测序分析，验证阳性样品DNA条带是否属于流行性乙 型脑炎病毒
扩增产物的DNA条带为430bp，与阳性对照一致，同时阴性对照无条带；且测序分析验证为流行 性乙型脑炎病毒，即判为阳性
8.1.1 试管（7.5cmX1.0cm）。 8.1.2 吸管（10mL、2mL、1mL）。 8.1.3 试管架。 8.1.4 水浴锅（37℃～38℃）。 8.1.5 离心机。 8.1.6离心管。
8.2.2溶血素：效价大于1：5000。 8.2.3补体：取3只～5只成年豚鼠新鲜血清混合而成。 8.2.41%绵羊红细胞悬液：采集适量健康绵羊抗凝血，加人2.5倍～3倍体积的阿氏液（见B.1），可放 于4℃冰箱保存1个月。用时取适量绵羊红细胞悬液，加入5倍～10倍体积的生理盐水（见B.2），充分 混匀，以2000r/min离心15min，弃上清液。如此洗涤3次。再加入5倍～10倍体积的生理盐水悬浮 红细胞，充分混匀，以2500r/min离心15min，弃上清液，沉淀的红细胞以生理盐水配成1%红细脂 县液
8.2.2溶血素：效价大于1：5000。 8.2.3补体：取3只～5只成年豚鼠新鲜血清混合而成。 3.2.41%绵羊红细胞悬液：采集适量健康绵羊抗凝血加入2.5倍～3倍体积的阿氏液（见B.1），可放 于4℃冰箱保存1个月。用时取适量绵羊红细胞悬液，加入5倍～10倍体积的生理盐水（见B.2），充分 混匀，以2000r/min离心15min，弃上清液。如此洗涤3次。再加人5倍～10倍体积的生理盐水悬浮 红细胞，充分混匀，以2500r/min离心15min，弃上清液，沉淀的红细胞以生理盐水配成1%红细胞 县液
8.2.5标准阳性对照血清
GB/T 186382021
8.3.1被检血清：应于发病早期和病后第4周各采血1次，无菌分离血清，密封装入灭菌小瓶，2℃~ 8℃保存或一20℃长期保存。操作过程中应避免污染，且须保证血清新鲜透明不溶血。 8.3.2灭活处理：试验前应将标准阳性血清、标准阴性血清及被检血清进行灭活。灭活时间均为 30min。不同种类动物灭活温度存在差异，其中豚鼠56℃，马58℃～60℃，人、猴及小鼠60℃，牛、水 牛、山羊、狗、猪及仓鼠62℃，骤和驴63℃～64℃，家兔65℃
8.4.2.1试剂的稀释
来进行样 3.4.2.1.2将灭活后的标准阳1 血清及被检血清分别进行2倍连续系列稀释。标准阳 性血清稀释倍数要大于其标注效 般作3个连续稀释梯度
8.4.2.2操作程序
8.4.2.2.1取3排小试管，每排6支，按照拟加人的抗原类型均分为3组，即流行性乙型脑炎抗原组、正 常对照抗原组、钙镁溶液组。 8.4.2.2.2将倍比稀释的被检血清分别加入到对应的小试管中，具体操作程序见表1。 8.4.2.2.3于各稀释度的血清中分别加入0.1mL抗原，即流行性乙型脑炎抗原、正常对照抗原、钙镁 溶液。 8.4.2.2.4 于各管中加入补体0.2mL。 8.4.2.2.5振荡摇匀，4℃冰箱过夜感作。 8.4.2.2.6于各管中加入致敏绵羊红细胞悬液0.2mL.。 8.4.2.2.737℃水浴感作30min，而后对结果进行判定
8.4.2.3.1 标准阳性血清：按照8.4.2.2操作进行。 8.4.2.3.2 标准阴性血清：按照8.4.2.2操作进行。 8.4.2.3.3 血清抗补体稀释对照：按照表2操作进行 8.4.2.3.4 红细胞对照：按照表2操作进行。 8.4.2.3.5 抗原对照：按照表2操作进行。 8.4.2.3.6 补体对照：按照表2操作进行
去。各对照组结果如下： a） 标准阳性血清：抑制溶血，结果与已知效价相差士1个滴度； b 标准阴性血清：100%溶血（一）； 血清抗补体对照组：100%溶血（一）； d 红细胞对照组：不溶血（十十十十）： e） 抗原对照组：不溶血（十十十十）； SA 补体对照组：50%溶血（+十）。 3.5.2结果表示方法见C.3.2。血清效价以50%抑制溶血（十+)为判定终点（溶血判定示意图见图D.1) 3.5.3结果判定：患畜恢复期血清比急性期血清的抗体滴度增长4倍以上，可诊断为JEV感染病畜 单份血清抗体滴度1：16以上，结合临床症状，可诊断为JEV感染病畜。1：4可作为马骤感染的最低 抗体滴度，重复试验仍达到1：4，结合临床症状，可诊断为JEV感染病畜
5.2结果表示方法见C.3.2。血清效价以50%抑制溶血（ ）为判定终点（溶血判定示意图见图D 5.3结果判定：患畜恢复期血清比急性期血清的抗体滴度增长4倍以上，可诊断为JEV感染病 份血清抗体滴度1：16以上，结合临床症状，可诊断为JEV感染病畜。1：4可作为马骤感染的量 亢体滴度，重复试验仍达到1：4.结合临床症状，可诊断为JEV感染病畜
9血凝抑制试验检测方法
9.1.196孔V型微量血凝板，
9.1.3 10mL无菌注射器。 9.1.4天平(0.0001g）。 9.1.5微型振荡器。 9.1.6普通低速离心机。 9.1.7 离心管。
.2.4鹅红细胞悬液.配制步骤如下
9.2.6血清，处理步骤如下
a 取光浴谷 b） 取30μL上述灭活血清，加人120μL0.4%pH9.0硼酸盐缓冲液（BBS），再加150μL25%的 白陶土悬液。 C） 室温作用20min，间歌振摇。1000r/min，4℃离心30min，上清液即为10倍稀释的血清。 d 吸出上清液加人新的离心管，用1/50体积的沉积鹅红细胞泥加入到血清中，轻轻吹打均匀，使 鹅红细胞能充分吸附血清中非特异性的凝血因子，冰浴或4℃放置20min。800r/min，4℃ 离心10min，上清液即为处理好的待检血清（1：10）
9.3.1在96孔V型板第2行至第8行滴加4%的BBS25μL/孔（按照表3操作进行）。 9.3.2在第1至11列的第1、2、8孔滴加处理好的血清25μL/孔，第2孔倍比稀释至第7孔，弃去 5L（按照表3操作进行）。 9.3.3在第1至11列各孔加25μL8个血凝单位的乙脑病毒。第12列的第1、2孔加8个血凝单位的 病毒，从第2孔倍比稀释到第7孔，第8孔作为阴性对照孔；第12列的第1至第8孔各加25μL4% BBS，使整块板的反应体积达到50μL/孔。盖上96孔板塑料盖，将血凝板放置于室温20min～30mir （按照表3操作进行）。 9.3.4轻轻摇匀PBS稀释好的鹅红细胞悬液，每孔加人鹅红细胞50μL，盖上96孔板塑料盖，再置室温 作用30min~45min或过夜后判定结果
9.4.1.1100%凝集（十十十十），呈薄膜状，凝集颗粒均匀分布整个孔底。 9.4.1.275%凝集（十十十），孔底有红细胞呈滴状，周围已形成膜状。 9.4.1.350%凝集（十十），血滴周围有凝集颗粒，不呈膜状， 9.4.1.425%凝集（十），血滴周围仅有少量凝集颗粒。 9.4.1.50%凝集（一），呈圆滴状沉淀于孔底，无凝集颗粒
参考判定标准（示意图见图D.2），患畜血清HI效价达到1：16，同时50%红细胞发生凝集，判为 JEV抗体阳性
间接ELISA抗体检测
10.1.1 酶标仪（含630nm滤光片）。 10.1.2 恒温孵育箱。 10.1.3 多通道连续移液器（规格300μL）。 10.1.4 自动洗板机。 10.1.5 精确单道移液器（规格0.5μL~10μL、10μL200μL和1mL~10mL）。 10.1.6 多道移液器（规格30μL～300μL）。 10.1.7 U底8X12孔血清稀释板。 10.1.8 3计时器。
10.1.1 酶标仪（含630nm滤光片）。 10.1.2 恒温孵育箱。 10.1.3 多通道连续移液器（规格300μL）。 10.1.4 自动洗板机。 10.1.5 精确单道移液器（规格0.5μL~10μL、10μL~200μL和1mL~10mL） 10.1.6 多道移液器（规格30μL~300μL）。 10.1.7 U底8×12孔血清稀释板。 10.1.8计时器
GB/T 186382021
10.1.9 V底型加样槽。 10.1.10 量筒（规格100mL和2000mL）。 10.1.11 其他不同规格标准吸头（与移液器配套） 10.1.12 一次性PE手套。 10.1.13 封板膜。 10.1.14吸水纸。
10.2.1血清稀释液，见附录E中E.1。 10.2.2 PBS,见E.2。 10.2.3 碳酸盐缓冲液，见E.3。 10.2.4 PBST,见 E.4。 10.2.5 封闭液，见E.5。 10.2.6 底物液A，见E.6。 10.2.7 底物液B，见E.7。 10.2.8 终止液，见E.8。
10.3.1样本的采集与处理
米集动物时，每只动物使用 开行前腔静脉或耳静脉无困采，不少于2m 温静置于斜面2h，待血液自然凝固后，置2℃～8℃冰箱中放置不少于2h，800r/min，4℃离心 0min。用移液器小心吸出上层血清。
10.3.2血清样本的存放与运送
血清样本若在一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存。若超过一周检测，应置一20℃以下冷冻 保存。运输时注意冷藏，确保样品有效。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输 时间应尽量缩短。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。
10.4.1JEV灭活抗原
10.4.2HRP标记羊抗被检动物IgG
将其用PBST稀释至最适浓度
将其用PBST稀释至最适浓度
10.4.3阳性对照血清
用乙脑活疫苗免疫正常被检动物制备的高免血清，测定其抗体效价后作为试验中的阳性对照血清， 同待检血清一起作同样稀释
10.4.4阴性对照血清
阴性对照血清来自健康被检动物，间接ELISA抗体检测方法检测的ODs30nm值应<0.2。 12
10.5.1抗原的包被：将灭活浓缩的乙脑病毒用包被液稀释后加到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃放置 15h。 10.5.2洗涤：弃去板孔中的溶液，加入稀释好的洗涤液200μL/孔，静置3min后倒掉，再在吸水纸上 拍干，共计洗涤3次。 10.5.3封闭：加入封闭液100μL/孔，置37℃下温育1h。 10.5.4洗涤：方法同10.5.2。 10.5.5加入待检血清：将待检血清、阴性对照血清及阳性对照血清用血清稀释液按照1：40稀释，将 已稀释血清各取100μL加至抗原包被板中，待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样 品，置37℃下温育30min。 10.5.6 洗涤：方法同10.5.2，共计洗涤5次。 10.5.7 加酶标二抗：每孔加羊抗被检动物酶标二抗100μL，置37℃下温育30min。 10.5.8 洗涤：方法同10.5.2，共计洗涤5次。 10.5.9 加底物：每个反应孔加入底物液A1滴（约50μL)和底物液B1滴（约50μL），混匀，置室温避 光显色10min。 0.5.10 加终止液：待显色结束后每个反应孔中加人终止液1滴（约50μL），10min内测定结果 10.5.11 结果测定：在酶标仪上采用630nm处的吸光光度值（OD630nm值）测定检测结果，
10.5.1抗原的包被：将灭活浓缩的乙脑病毒用包被液稀释后加到96孔酶标板中，100uL/孔，4℃放置 15h。 10.5.2洗涤：弃去板孔中的溶液，加入稀释好的洗涤液200μL/孔，静置3min后倒掉，再在吸水纸上 拍干，共计洗涤3次。 10.5.3封闭：加入封闭液100μL/孔，置37℃下温育1h。 10.5.4洗涤：方法同10.5.2。 10.5.5加入待检血清：将待检血清、阴性对照血清及阳性对照血清用血清稀释液按照1：40稀释，将 已稀释血清各取100μL加至抗原包被板中，待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样 品，置37℃下温育30min。 10.5.6洗涤：方法同10.5.2，共计洗涤5次。 10.5.7 加酶标二抗：每孔加羊抗被检动物酶标二抗100μL，置37℃下温育30min。 10.5.8 洗涤：方法同10.5.2，共计洗涤5次。 10.5.9 加底物：每个反应孔加入底物液A1滴（约50μL)和底物液B1滴（约50μL），混匀，置室温避 光显色10min。 10.5.10 加终止液：待显色结束后每个反应孔中加人终止液1滴（约50μL），10min内测定结果 10.5.11 结果测定：在酶标仪上采用630nm处的吸光光度值（OD630nm值）测定检测结果，
试验成立条件：阳性对照孔OD630nm值均应≥1.0，阴性对照孔OD630m值均应<0.2。计算样品的 S/P值（S为样品ODs30mm值，P为阳性对照ODs30m值平均值）。若S/P值≥0.21，判为被检动物JEV 亢体阳性：若S/P值<0.21.判为被检动物JEV抗体阴性
试验成立东件：阳性对照机（儿630 m值均应1.0，阴性对照扎D0m值均应<0.2。计算样品的 S/P值（S为样品ODs30mm值，P为阳性对照ODs30mm值平均值）。若S/P值≥0.21，判为被检动物JEV 抗体阳性：若S/P值<0.21，判为被检动物JEV抗体阴性
11间接免疫荧光试验（IFA)检测方法
11.3.1感染细胞的制备
11.3.2.1细胞病变（细胞圆缩、破裂）约达60%~80%时，收集细胞培养物，以1500r/min离心 10min，弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物3次，用PBS重悬细胞 11.3.2.2取10μL细胞悬液，滴加于抗原片各孔中，同时制备正常细胞对照片。 11.3.2.3吹干滴好的抗原片，用4℃预冷的丙酮固定10min，保存于一20℃，一周内使用
3.2.1细胞病变（细胞圆缩、破裂）约达60%~80%时，收集细胞培养物，以1500r/min离 min，弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物3次，用PBS重悬细胞。 3.2.2取10μL细胞悬液，滴加于抗原片各孔中，同时制备正常细胞对照片。 3.2.3吹干滴好的抗原片，用4℃预冷的丙酮固定10min，保存于一20℃，一周内使用
11.3.3间接荧光抗体染色
1.3.3.1取出抗原片室温放置10min待用 1.3.3.2用PBS将待检血清、阴性血清及阳性血清分别稀释成1：100和1：500两个稀释度，分别取 0uL滴加于抗原片各孔中。 1.3.3.3将加样抗原片置于湿盒内，37℃孵育30min。 1.3.3.4 用PBS浸洗3次，每次10min。 1.3.3.5 取20μuLFITC标记的抗被检动物IgG滴加于上述处理过的抗原片各孔中，孵育同11.3.3.3， 先涤同11.3.3.4。 11.3.3.6取级冲甘油封片.置于荧光显微镜下观察
11.4.1未感染病毒细胞对照：正常细胞制备的抗原片中，加入阳性血清，细胞内无荧光颗粒。 11.4.2阴性对照血清：JEV感染细胞制备的抗原片中，加入阴性血清，细胞内无荧光颗粒。 11.4.3 阳性对照血清：JEV感染细胞制备的抗原片中，加人阳性血清，细胞内可见清晰的黄绿色荧光 颗粒。 11.4.4在以上条件成立的基础上，进行检验血清判断
JEV感染细胞制备的抗原片中，加人待检血清，细胞内可见清晰的荧光颗粒，判为血清中JEV抗体 阳性。
12病毒中和试验检测方法
12.1.1恒温CO2培养箱。
12.6.1细胞层染色呈蓝色为阳性孔（病毒被中和），不着色为阴性孔（病毒未被中和），以血清能够中和 50%病毒时的稀释度为血清最终滴度。 12.6.2被检血清最终滴度为1：4或更高者判定为阳性。 12.6.3被检血清最终滴度低于1：4判定为阴性。 12.6.4 被检血清最终滴度在1：2和1：4之间判定为可疑，重复试验结果为1：4或更高时判定为 阳性
12.6.1细胞层染色呈蓝色为阳性孔（病毒被中和），不着色为阴性孔（病毒未被中和），以血清能够中和 50%病毒时的稀释度为血清最终滴度。 12.6.2被检血清最终滴度为1：4或更高者判定为阳性。 12.6.3被检血清最终滴度低于1：4判定为阴性。 12.6.4 被检血清最终滴度在1：2和1：4之间判定为可疑，重复试验结果为1：4或更高时判定为 阳性
50XTAE: 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 乙二胺四乙酸二钠（NazEDTA·2H,O) 去离子水(H2O) 冰乙酸(CH,O) 加去离子水至1000mL
B.3钙镁溶液（用于补体结合试验检测方法
附录B （规范性附录
体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法用试剂配制
母液1:0.05mol/L硼砂（Na2B,O，·12H2O)溶液，硼砂5.2g，加双蒸馏水或无离子水至250ml 母液11：0.2mo1/L硼酸（H3BO3）溶液，硼酸1.2g，加双蒸馏水或无离子水至100mL。 使用液：母液1132mL十母液1I18mL十生理盐水460mL。配制后测定pH值，如不到9.0，可 量0.05mol/L硼砂溶液。105kPa20min高压灭菌。临用前，在使用液中添加0.4%牛血清白蛋白
B.5不同pH值磷酸盐缓冲液（PBS)
母液1：1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO,）溶液，无水磷酸氢二钠9.47g，加双蒸馏水或无离子水 至1000ml。 母液Il:1/15mol/L磷酸二氢钾（KH2PO，）溶液，磷酸二氢钾9.08g，加双蒸馏水或无离子水至 1000mL。 pH5.8PBS：母液18.0mL+母液II92mL+生理盐水566mL； pH6.0PBS母液112.2mL+母液II87.8mL十生理盐水566mL； pH6.2PBS：母液118.6mL十母液II81.4mL十生理盐水566mL； pH6.4PBS:母液126.7mL+母液II73.3mL十生理盐水566mL； pH6.6PBS：母液137.5mL+母液II62.5mL+生理盐水566mL； pH7.4PBS：母液I80.8mL+母液II19.2mL+生理盐水566mL。
JR/T 0228-2021 环境权益融资工具B.625%自陶土悬液（用于血凝抑制试验检测方
取优质白陶土粉末25g，加pH7.4磷酸盐缓冲液至100mL，105kPa20min高压灭菌4℃保存 可用1个月。临用前摇匀。
C.1.1溶血素的稀释
附录C （规范性附录） 补体结合试验检测方法的预备试验
吸取溶血素0.1mL（含50%甘油者用0.2mL)，加钙镁盐水9.9mL（含50%甘油者加9.8mL）， 后即为1：100的溶血素，然后取1：100溶血素1mL加钙镁盐水4mL，即为1：500的溶血素。 表C.1进行稀释。
表 C.1溶血素稀释液制备
C.1.2溶血素的滴定
已稀释的溶血素吸到另一排小试管内FZ/T 20028-2015 分梳山羊绒 纤维长度和长度分布的测定 光电法，每管0.1ml，然 后按表C.2依次加入补体、钙镁盐水及1%绵羊 摇匀后，置37℃水浴中30min，观察结果。
表 C.2溶血素的滴定