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GBT 39730-2020 细胞计数通用要求 流式细胞测定法.pdf5.1.7荧光补偿样品
荧光补偿样品为单荧光染色细胞或者荧光补偿微球 荧光补偿样品的荧光染料应与待测细胞所用 的荧光染料一致。荧光补偿样品的荧光强度至少要与 一致，或者超过待测细胞的荧光强度
5.2.1 流式细胞仪
应具有荧光检测通道和散射光检测通道，荧光通道能够检测选择的荧光染料，散射光检测通道包括 FSC和SSC。 流式细胞仪应经过校准，并定期核查准确度和精密度
微量移液器量程为10μL～1000μL。微量移液器应经过检定或校准DB37T 2297-2013 海水贝类养殖区污染物筛选技术规范，并定期核查其移取量的 和精密度。
涡旋振荡器使用的涡旋转速不应大于3000r/min。使用者应监测并记录涡旋振荡器的使用转速 时长等条件
5.2.4温度控制装置
用于细胞染色的孵育温度控制或试剂、样本的保存，例如冰箱。使用者应监测并记录温度控制装置 的温度准确度和稳定性。
根据原始样本的类型选择合适的待测样本制备方式。待测样本应是单分散细胞悬液，即待测 的细胞以单个细胞存在，没有细胞团或细胞碎片
运送条件应不影响待测细胞的生物特性和检测
5.3.4. 1细胞染色
细胞染色前，应根据流式细胞仪的性能参数、待测细胞的黏附、自然沉降等特性来调整样本中的细
胞浓度。 如果细胞浓度过高，可用缓冲溶液对待测样本进行稀释，并记录稀释倍数。 根据荧光染料或特异性的荧光染料标记抗体质量参数确定样本量及染料、抗体浓度、孵育条件。 保证待测样本和荧光染料或特异性的荧光染料标记抗体充分混合，应选择合适的涡旋转速和时长， 转速过高或时间过长会造成细胞破损。 待测样本完成细胞染色后，尽快进行上机检测。如果无法尽快上机检测，可通过固定剂进行固定并 适当条件保存，宜4℃~8℃避光保存
5.3.4.2计数标准微球添加
对满足溯源至有证标准物质条件的计数标准微球进行准确添加，应采用反向抽吸法，向装有待测科 本的进样管中加入充分混匀的计数标准微球溶液，或者在计数标准微球十粉中加入待测样本 添加计数标准微球后应避免样本的离心洗涤导致的计数标准微球丢失。 样本处理完成后应尽快上机试验，上机前进行充分混匀，避免放置导致的细胞和计数标准微球沉 降。应选择合适的涡旋转速和时间，转速过高或时间过长会造成细胞破碎或计数标准微球吸附管壁。 可对被测样本和计数标准微球的移取量进行精确称量，提高测量准确度和精密度
行校验，可参考流式细胞仪的校验参数检测FSC
5.4.3细胞计数测量
5.4.3.1对照设置
应设置阴性对照、阳性对照、同型对照、荧光扣除对照，用于识别目标细胞并确认目标细胞的染色方 案是否正确。 使用不含任何荧光染料及计数标准微球的待测细胞样本作为阴性对照 使用已经证明可有效地与待测荧光染料结合的细胞样本作为阳性对照， 使用与荧光染料标记的抗体相同种属来源、同种免疫球蛋白的相同亚型的相同剂量抗体染色的细 胞样品作为同型对照。 使用两个和两个以上的荧光染料或荧光染料标记抗体组合标记细胞样本时，在完整的染色基础上 使用减少一种荧光染料或荧光染料标记 样本作为荧光扣除对照
进样间隔期间，应使用清洗液对仪器管道进行清治
5.4.3.3设定阅值、电压
选择合适的检测通道后，根据使用的荧光染料或相关试剂盒提供的质量参数设置系列双参数散 单参数直方图和阅值
号中区分出目标细胞的阳性信号并进行设门
应在进样稳定后开始采集信号。 总细胞信号采集数量不应小于10000个，计数标准微球信号采集数量不应小于1000个。若总细 胞信号采集数量为10000个时，不能获取1000个计数标准微球采集数量，则应加大总细胞信号采集 数量。 信号采集时间应保持在合理范围内，过长时间可能导致细胞发生聚集或细胞、计数标准微球的 沉降。
5.5.1计数标准微球法
GB 50968-2014 露天煤矿工程施工规范按照公式（1）计算目标细胞的浓度值：
Nell X 4RS N ball
N cell XL N ball
目标细胞浓度，单位为个每微升（个/uL）； 获取目标细胞数量，单位为个； Vball 获取计数标准微球数量，单位为个； 样本中添加的计数标准微球数量，单位为个； 待测样本加样体积（不含荧光染料或特异性的荧光染料标记单克隆抗体溶液，计数标准微 球悬浮液等添加物体积），单位为微升（μL）； 样本稀释倍数
计数直接来源于流式细胞仪数据，由专用软件直接计算生成
应对具体测量方法进行方法性能确认。方法性能参数包括准确度、精密度、工作范围（检出限、线性 范围等）、特异性、方法稳健性和组间精密度（如操作者间、仪器间和目间变化）等。 应建立评估方法性能参数的方案和标准，制定并保存相应的文件
报告提供的信息应至少包括： a) 使用仪器信息SN/T 2946-2011 乙烯-乙酸乙烯酯共聚物中乙酸乙烯酯含量的测定 傅立叶变换红外光谱法，包括仪器的参数设定； 试剂名称、来源、批号； c) 测量结果； 数据分析程序； SAG e）意外情况
GB/T397302020