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蜂蜜中链霉素残留物的Charm II测定和液相色谱柱后衍生化-荧光检考试证

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蜂蜜中链霉素残留物的Charm II测定和液相色谱柱后衍生化-荧光检考试证


Detection of Streptomycin Residues in Honey Using the Charm II-test and Confirmation of Results through HPLC with Post-column Derivatisation and Fluorescence Detection

弁言

自1994年植物掩护剂植物抗生素在德国被有严酷前提的、暂且的和极为有限的应承用于节制生果的Feurbrand,它已被欧洲的其他一些国度和美国行使了好几年。含有有用因素链霉素的植物抗生素部门用于花期,这导致了蜂蜜中氨基糖苷抗生素的残留。由Usleber等[1]先容的用于测定蜂蜜中残留的酶化学免疫法测定功效在10~100μg/㎏。可是因为链霉素和双氢链霉素之间高度交错回响,因此用ELISA法不能声名这两种抗生素的不同。以是必要研究一种有足够迅速度的要领验证。
HPLC法是在Gerhardt等[2]提出在线富集HPLC测定纤维中链霉素的要领和Usleber等[1]提出的要领基本上提出的。由于其时市售ELISA试剂盒迅速度不足,基于测定美国Charm Science公司放射受体试验(Charm II 试验)的要领较得当于链霉素检测的筛选。

Charm II-尝试
试剂
-CharmII链霉素试剂盒(LD Labor Diagnostika,Heiden)
-MSU 和 M2缓冲液(试剂盒附带)
-玻璃棉,以磷酸处理赏罚

样品前提
厂方并未提供蜂蜜样品的处理赏罚要领,按原料[3]样品处理赏罚要领举办如下处理赏罚:
取10g蜂蜜于聚四氟乙烯离心管内,加10mL MSU 缓冲液,在震荡机上震荡10分钟,直至蜂蜜完全消融。经玻璃棉过滤,以M2缓冲液调滤液pH至7.5。按厂方声名举办测试,不外测试前必需静置1小时以上,以得到恒定的测定值。

说明和接头
此尝试说明是半定量的。每组尝试至少有两个浓度在10到30μɡ∕㎏之间的加标样品。通过对付这些阳性节制样品测定值的较量,高于20μɡ∕㎏链霉素的样品就可以获得确认。10到20μɡ∕㎏的测定值也可以清晰地与空缺样区分,用这个要领不能确切的测定小于10μɡ∕㎏的链霉素,由于节制样(标样)也会在必然范畴内颠簸。
可以确定,用这种要领测定双氢链霉素也有大抵沟通的迅速度。正如ELISA法一样因为双氢链霉素的交错回响偶然功效会大于100%[4,5]。CHARM II法的利益在于样品的制备和尝试进程异常轻盈和快速。只要有所需的仪器装备,与ELISA法对比这种要领更为有用,纵然是少量的样品。

HPLC要领
* 译自Lebensmittelchemie 50, 115-117, (1996).
化学试剂和溶液
-用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH 8);
-0.2mol/L氢氧化钠 (称8g氢氧化钠溶于1L水),按行使要求过滤和脱气。
-pH 2的高氯酸溶液(用水稀释高氯酸)
-醋酸 99.7%
-玻璃棉,以磷酸处理赏罚
-阳离子互换柱:苯磺酸-固相柱(SO3H)(Baker3mL,Order No。7090-03)。回收其他牌号时必要在行使前搜查接纳率。
-C18-固相柱:将500mg C18担体(Flash)(Baker, Order No.7025-00,Batch F 01081)在3mL玻璃柱顶用10mL甲醇浸湿然后装填在聚四氟乙烯小管中。回收其他牌号时必要在行使前搜查接纳率。
-甲醇,正己烷,叔丁基甲基醚(TBME)
-硫酸链霉素()
-庚基苯磺酸水溶液:0.5 mol/L(用Serva 公司 1-庚基苯磺酸钠盐制备)
-HPLC溶液(B):10 mmol/L,pH 3.3(2.02g 1-庚基苯磺酸钠盐溶于水,用乙酸调pH至3.3)
-溶剂体系A:1-庚基苯磺酸(10mmol/L)和1.2-萘醌-4-苯磺酸(0.4mmol/L)的水溶液+乙腈(80+20);用乙酸调pH至3.3;当天新设置(不然会低落迅速度并升高配景信号)。
-溶剂体系B:乙腈

参比溶液及其配制
母液:100mg链霉素溶于100mL水中(1000μɡ∕mL)
事变液(A):1mL母液溶于100mL水中(10μɡ∕mL)
行使液:2mL事变液溶于10mL水中(2μɡ∕mL):行使前新配制。
外标液:
mL A + mL H2O加10 mL B =μɡ∕mL
0.1 0.9 0.1
0.2 0.8 0.2
0.3 0.7 0.3
0.5 0.5 0.5
设置: 将100μL (150μL, 250μL)行使液插手10ɡ 蜂蜜中,静置5分钟(20,30,50μɡ∕㎏)

样品处理赏罚
称取10g蜂蜜于可密封聚四氟乙烯离心管中, 加25mL高氯酸溶液,在震荡器(250/min)上震荡10分钟直至蜂蜜完全消融。
用阳离子互换柱举办初次净化,用5mL水和2mL高氯酸浸泡。将蜂蜜溶液离心(10分钟,4500 G/min)上清液通过填有玻璃棉的漏斗过滤至备用容器顶用于固相萃取,在抽真空前提下通过固相柱。然后用5mL高氯酸溶液洗濯漏斗。阳离子互换柱用10mL水洗濯,洗脱液和20mL磷酸缓冲液一路放到离心管里。插手2mL 庚基苯磺酸溶液, 滴加磷酸调解pH至2。
为了进一步的净化和浓缩,需用5mL水浸湿已筹备好的C18固相柱。为停止堵塞,这根柱子要再离心10分钟(4500 G/min)。再把上清液倒入容器中再逐步让其流过牢靠柱。在用10mL水洗濯(吸干5分钟)和4mL TBME/己烷(80/20)洗濯(吸干5分钟)后为去除残余水分在低真空前提下用6 mL甲醇再洗涤至沉渣瓶。用旋转蒸发器将洗脱液浓缩至很小体积,残余液体用氮气吹干。只要尚有残余的水分就要用乙醇在旋转蒸发器上去除。借助于玻璃搅拌器把残渣溶于1mL HPLC溶液中,玻璃部门要以溶剂潮湿,把溶液转移到微型样品瓶中。假如不是当天测定样品瓶要冷冻生涯。在室温下解冻20-30分钟后按要求离心(4000G/min)
样品制备要点
对付大大都蜂蜜样品可以回收不消阳离子互换柱的简朴步伐制备。把样品蜂蜜溶于25mL缓冲液(1-庚基苯磺酸 50mmol/L,磷酸钠,25mmol/L,用磷酸调pH至2),按上述步调离心,过滤,再通过玻璃棉漏斗过C18柱,后续操纵同上。
要确证阳性功效,无论怎样要增进阳离子互换净化步调,以便获得干净的基线。出格是光华很深的蜂蜜,尽量离心和过滤,在2-3小时里照旧不能顺遂通过离子互换柱。在这种环境下我们提议采纳重复处理赏罚少量蜂蜜再添加到一路的步伐。

液相色谱前提
液相色谱仪 惠普1090 II型
色谱柱: Hypersil BDS C-18
100×4 mm; 3μm(HP)
预柱: ODS 20×2.1mm;
10μm(自添补)
柱温: 40 ℃
进样体积: 100μL
流速: 0.8mL/min
溶剂体系:等梯度操纵(98% 溶剂 A+2%溶剂 B)
柱后衍生化
柱后衍生化体系 655A-13型(Merck Hitachi)
试剂: NaOH 0.2 mol/L
流速: 0.4mL/min
温度: 50℃
回响盘管: 长10m, 内径0.33mm(Merck)
荧光测定
荧光检测器HP 1046A
引发波长λex=263nm,发射波长λem=435nm
增益:11

 

色谱法要点
萤光检测器的最佳引发波长在210到300nm之间.尽量光谱的接收取决引发和发射波长,其功效与Gerhardt先容的前提下对比迅速度险些跨越了5倍。
尽量举办了两次净化在链霉素区段如故经常会有小的滋扰峰,这可以用改变色谱前提的步伐去除。固然回收了1-庚苯磺酸[2],链霉素的保存时刻照旧太长,以是不得不思量进步乙腈比例来收缩保存时刻。在乙腈比例为20%时杂质峰明明在链霉素出峰之前。最佳的总出峰时刻溶剂体系B,乙腈的最终比例到22%,这样已使链霉素的保存时刻收缩了7分多钟。用纯乙腈作为第二溶剂使我们进一步优化色谱前提,象收缩总运行时刻,插入其他疏散柱来把链霉素与杂质峰分隔。在改变液相色谱前提和柱后衍生化前提,就是说差异的流速前提下可以看到衍生化的pH值约莫为12.5。(丈量池后丈量的pH值!)。较低的pH值会明明低落迅速度,而pH值过高则也许破坏体系,由于厂家已经声明丈量池行使pH值不得高于9。因为必需行使高pH值,仪器体系在样品丈量完后必需彻底洗濯。
在约莫持续进20个样和标样后经常会呈现拖尾,改换预柱是得到精采峰形,进步迅速度的原则。因为污染和外标溶液经常会呈现标样峰加宽。因此在改变样品时经常测定一系列尺度,这样可以到达链霉素恒定半峰宽为0.6分钟的程度。

说明和接头
接头是按照外标(尺度曲线)举办的,不外对付“原样”或加标样来说与外标对比保存时刻漂移约莫1%,链霉素均匀出峰时刻要提前0.1到0.2分钟。因此每次测按时也应该测定一个加标样。
图1.为某空缺蜂蜜样和加有30μɡ/kg链霉素的统一蜂蜜的色谱图。图2.为响应外标的色谱图。图2中所
加外标为0.1μg/mL(相等于样品中10μg∕㎏链霉素)暗示了本法的检测迅速度,其信号仍有基线噪音程度的六倍。
加标尝试在三个浓度程度举办,中间(18个点)接纳率为78%(表1)
在给定前提下也可以同样测定双氢链霉素。它在链霉素之后流出,可是不管变革身分有几多也无法获得基线疏散。与链霉素对比双氢链霉素的检测迅速度只有一半,接纳率相似。

尝试功效与评估

到今朝为止用两种要领平行地测定了59个蜂蜜样的链霉素。在Charm II的半定量功效和HPLC功效都有精采的相干性。
在表2中总结了HPLC法的尝试功效。两批商品花蜜发明链霉素含量最高到达43μɡ∕㎏。今朝这些蜂蜜(中国和墨西哥)只有一种确定了来历。另一批的链霉素含量到达27μɡ∕㎏是从墨西哥,法国,和罗马尼亚蜜殽杂成的。在欧洲丛林蜜(从土耳其,保加尼亚,意大利,波兰和罗马尼亚蜜殽杂成的)中也可以检测出链霉素。在制品蜜中,首要是来自Bdensee 地域和硬核果树种植地域没发明链霉素残留。
双氢链霉素首要用作兽药,在蜂蜜中没发明残留。这就增强了链霉素残留不是因为犯科行使链霉素作为蜜蜂兽药的概念,而以为是把植物抗生素用在农业上作植物掩护剂,蜂蜜又是以后得到的缘故。在德国植物抗生素的行使仅限于经核准的破例环境下,因此此刻在“最高残留限量VO”(VO=法定)的框架内并没有对它划定最高应承量。在用作卫生医药时对牛,羊,猪和禽链霉素和双氢链霉素应承姑且MRL(限量)高达1.6.2000。牛奶的MRL值为200μg∕㎏,肌肉,肝,和脂肪为500μɡ∕㎏,肾脏为1000μɡ∕㎏。因此这次尝试所确定的残留现实上都低于最根基的食物牛奶中卫生医药残留的应承最高限量。可是,在将来残留题目将始终引起存眷,由于思量到在德国“Feuerbrand”传播的越广,植物抗生素的行使也越广。响应的地产蜂蜜的残留也会呈现。

表1. 差异浓度链霉素的接纳率(%)
浓度(μɡ∕㎏) 20 30 50
1 81 82 72
2 92 82 79
3 72 83 77
4 71 82 65
5 80 75 68
6 86 77 78
均匀 80.3 80.2 73.2
尺度毛病 8.1 3.3 5.8
变异系数(%) 10.0 4.1 7.9
 

表2. 尝试功效
数量 <10 →20 →30 >30
商品蜜
花蜜 (一样平常) 27 19 31 31 2
加工蜜(特定) 8 8
原蜜 13 10 32
成蜜3
花蜜 8 8
原蜜 3 3

总计 59 48 6 3 2

1从一个出产厂所取的具有沟通品格但差异批次的3个样品
2一个出产厂所取的具有沟通品格但差异批次的样品
3来自Tubingen 地域(巴登-威登堡)

图1.插手30μɡ∕㎏的样品蜜和节制样的色谱图(接纳率82%)

图2.外加0.3ńɡ∕μL和0.1ńɡ∕μL链霉素尺度(别离相等30μɡ∕㎏和10μɡ∕㎏蜂蜜样)的色谱图

译者 校者

参考资料
1. Usleber E, Dietrich R et al. (1995) Arch Lebensmittelhyg 46:94-96
2. Gerhardt G. Salisbury C, MacNeil J (1994) J Assoc Off Anal Chem 77:334-337
3. Charm Science Inc, Malden/USA (1995) Operator’s Manual zum Charm II Test for Antimicrobial Drugs in Tissue
4. R-Biopharm GmbH (1996) Testbeschreibungizum Enzymimmunossay zur quantitativen Bestimmung von Streptomycin und Dihydrostreptomycin
5. Euro-Diagnostica, Transia (1996) Testbeschreibung zum Immunoezymatischen Nachweis von Streptomycin
6. VO uber Hochstmengen an Ruckstanden von pflanzenschutz- und Schadlingsbekampfungs-mitteloin, Dungemitteln und sonstigen Mitteln in oder auf Lebensmitteln und Tabakerzeugnissen vom 1.9.1994 (BGBI.IS.2299) I.d. aktuellen Fassung
7. EWG-VO 1140/96 (ABI. Nr. L 151/6 ff) zur Festsetzung von Hochstmengen fur Tierarzneimittel-ruckstande in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs


作者:admin 来源:网络收集 发布时间:2016年11月20日