RIA Screening Method for the Detecion of Chloramphenicol in Meat Milk and Eggs (EEC Sg3.3 Screening Method)
安详操纵留意事项及施舍
尝试中行使有机溶剂时按隐藏伤害品处理赏罚划定操纵，并在透风橱内举办。
弁言
氯霉素(CAP)是具有广谱性浸染的抗生素，作为兽药用于家畜疾病的提防和治疗。欧盟(EEC)在CVMP决策中划定不应承在蛋鸡和乳牛中行使。
1 主题内容
欧盟(EEC)对氯霉素拟定了全面限定行使的划定。为了确保农场主在蛋鸡和乳牛中不再行使氯霉素，同时为了对动物源肉品中氯霉素的监控因此从豢养场和屠宰场抽取的样品举办 筛选检测的目标，拟定了本法。一旦筛选呈阳性，必需进一步检讨确证。
2 应用范畴
本法用于肉、牛奶和蛋中氯霉素残留量的判断。要领检测限：牛奶和蛋，1 g/L或1 g/kg；肉10 g/kg.
3 参考文献
Commission Decision 93/256/EEClaying down the method for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action [OJ.NO.L.11814.4.93 PP 64-74]
ISO Standard 78/2-1982 layout for standards Part 2:Standard for chemical Analysis ISO Standard 5725(1986)
Radioimmunoassay for the measurement of chloramphenicol residues in eggs milk and meat.(1993)
Bundesgesundheitsampt Berlin
Arnold And lst Draft of the summary report of EEC Collaborative study “chloramphenical Methods ”July 1987-February 1988.
Arnold D Vom Berg D Boertz A. K Mallik U. and Somogyi A.(1984) Radioimmunologische Bestimmung Von Chloramphenicol-Ruckstanden in Musculatur Milch und Eiern Archiv Fur Lebensmittel Hygiene 35 121-148
Prei B. A Balizs G07 Bensch-Girke Th Gude A Boenke A. and Kroker R (1993)Preparation of reference materials for chloramphenicol in muscle and milk-date on puality criteriaIn Proc.Euroresidues ⅡConference Veldhoven NL. Vol. 2.558-562
4 界说
氯霉素含量是指按本法测得的肉、蛋和牛奶中氯霉素的量，以 g/L或 g/kg暗示。
5 要领概要
本要领包罗三个步调
──样品用乙酸乙酯提取；
──提取物用液－液分派法净化(对付牛奶样品用固相(SPE)净化法)
──用放射免疫法(RIA)举办检测和宣量。
6 原料
6.1 试剂
留意：全部试剂均为说明纯
6.1.1 乙酸乙酯
6.1.2 甲醇
6.1.3 *
6.1.4 正已烷
6.1.5 乙腈
6.1.6 异辛烷
6.1.7 氯化钠
6.1.8 乙醇 (绝对担保说明纯)
6.1.9 绵羊白卵白()
6.1.10 磷酸氢二钾
6.1.11 磷酸氢二钠
6.1.12 叠氮化钠
6.1.13 活性炭 Norit A pract
6.1.14 葡聚糖分子质量约莫70000道尔顿(Pharmacia 1702800)
6.1.15 水相液配制的闪烁液(Beckmann 270453721A)
6.1.16 氯霉素()
[留意：放射性标志的氯霉素(CAP)(6.1.17)和抗血清(6.1.18)可从BGA(Berlin)购得。
6.1.17 放射性标志的丙酰氯霉素，3-羟基-3-(4 -硝苯基)-2-(N /3H/丙酰基)-氨基丙烷1-醇，放射量，61 Ci/mmol (2.26TBq/mmol)TRQ5394，(由BGA特约合成)。所提供的产物为在乙醇中为14.47 ci/mL。贮存于－20℃下。
6.1.18 氯霉素单抗血清(BGA)
61.19 蒸馏水
6.1.20 冰
6.2 氯霉素尺度品
6.2.1 尺度溶液；氯霉素标样配于乙醇中浓度10ug/ml贮于4℃，至少可不变6个月。
6.2.2尺度事变溶液用磷酸缓冲液(6.3.1)稀释获得浓度为10 25 50 100 125 250 500 1250 2500ng/mL。改溶液限定一周内行使.
[留意：要领机能考查回收20个校正点]
6.3 溶液
6.3.1 磷酸盐缓冲溶液PH7.45。3.4g KH2PO4 3.55g Na2HPO4和0.5g叠氮化钠溶于950毫升水中。调理pH至7.45再用水定容至1升.
6.3.2 抗血清预稀释液1/200 (W/W) ；含2.5 mg/mL羊单抗血清(6.1.18)的磷酸缓冲液贮存于-20℃。
假如抗血清为冷冻干燥情势(BGA提供)则按如下操纵：
──将管子离心，以免丧失
──加1mL水
──在4℃下振荡留宿使其重组。
6.3.3 抗血清事变液 1/75000 (w/w)；取部门抗血清预稀释液(6.3.2)，稀释375倍，贮于＋4℃。
6.3.4 放射配体事变液取部门放射性标志的同素物(6.1.17)用磷酸盐缓冲液稀释获得1.08纳摩尔浓度的溶液当用配制贮存于4℃限定一周内行使。
6.3.5 活性碳悬浮液：将3g活性炭0.5克葡聚糖和0.25克羊单抗血清消融于1升pH7.45磷酸盐缓冲液(6.3.1)中混匀.
6.3.5 乙腈/4%氯化钠(1/1 v/v)；由等体积的乙腈与4%氯化钠溶液配制。
7. 仪器装备
7.1 加液器； 0-20 L 0-1000 L 0-5000 L
7.2 具塞离心管：10-12mL l15-20mL(Schmidt Germany )
7.3 微量试管 (Eppendort 3812)
7.4 其螺旋盖样品瓶 10-20mL (Beckmann)
7.5 容量瓶 10mL和100mL
7.6 自动加液器(“Dispensette”Brand Germany )
7.8 快速真空装置 (savant VSA)
7.9 管子搅拌器 型号HEIDOLPH “TOP-mix”
7.10 旋转搅拌器 具有旋转板，型号HEIDOLPH“Reax 2”
7.11 涡旋殽杂器
7.12 透风橱
7.13 真空离心机( UneEquipGermany)
7.14 液体闪烁计数器(Beckmann)
7.15 冷冻箱约莫-18℃至-20℃
7.16 冷藏室/冷冻室
7.17 巴氏移液管
7.18 试管 75mm×12mm
7.19 阐来日诰日平
7.20 冷冻离心机 (sorvall USA)
7.21 台式离心机
7.22 C18小柱 (sep-par C18 Waters-Millipore Cat No 519)
8. 样本和取样进程
注释：留意事项在ISO文件7812-1982和6.3.1节有所描写。下面注释源于2052/VI/84-EN中的附录Ⅱ.
8.1 样品天性状：牛奶、肉和蛋样品，应是被用来进性行残留物检测的样品。
8.2 样品量：样品量应能满意要领的测定以及一再测按时所需的量。
8.3 取样后的样品必需冷冻，贮存于－20℃以下。
9. 检测步调
9.1 检测样品的制备。
9.1.1 肉：取在0-4℃奇怪的肌肉组织样品并剁碎对付冻肉解冻后剁碎，混匀。样品待测前应在0－4℃中生涯，并在48小时内说明。如要贮存较长时刻，则应在－20℃以下冷冻或最亏得－80℃冷冻，担保其不变。
9.1.2 蛋：均质
9.1.3 牛奶：质料奶或任何经均质但未变性的经加温的牛奶。
9.2 肉和蛋的预提取处理赏罚
9.2.1 将3g毁坏肉或均质蛋置于离心管中
9.2.2 蛋样：滴加5ml惭腈，搅拌。 肉样：加8ml的乙腈/4%氯化钠的溶液(6.3.6) 。
9.2.3 充实殽杂成均质。
9.2.4 4000g离心10min
9.2.5 称取并转移至样品瓶中。
9.2.6 移取约1/6 (w/w)上清液至具盖的玻璃离心管中
9.2.7 加5m正已烷和2ml水并充实混和.
9.2.8 1700g离心5min
9.2.9 弃去上层
9.2.10 一再9.27至9.29步调
9.2.11 加3.5ml经乙酸乙酯饱和并混匀的水
9.2.12 1700g离心5min
9.2.13 分取有机相，并将其蒸发至干。
9.3 牛奶的提取
9.3.1 取1mL牛奶于玻璃试管中插手0.75mL*/异辛烷(3/2 v/v) 混匀.
9.3.2 4000g离心15min
9.3.3 取0.7mL上清液于C18小柱上。小柱预先按下列次序举办处理赏罚：
5mL甲醇；5mL氯仿；5mL甲醇和10mL蒸馏水淋洗。
9.3.4 样品经10mL蒸馏水(9.1.19)淋洗
9.3.5 加5mL乙腈/水(1/1 v/v)洗脱.
9.3.6 加5mL水(经乙酸乙酯饱和)抽提洗脱液中的氯霉素 1700g离心
9.3.7 移取上层液用真空浓缩器浓缩至干
9.3.8 加0.7mL磷酸盐缓冲液(6.3.1)消融残余物按9.5.2步调操纵
9.4 (原文无)
9.5 放射免疫说明
[留意：全部操纵步调必需在0℃的冰浴中举办]
9.5.1 用450mL磷酸盐缓冲液(6.3.1)消融肉/蛋提取液(9.2.13)。肉的提取液用缓冲液稀释约10倍使氯霉素于缓冲液的浓度约莫为150pg/200mL。
9.5.2 将下面溶液归并于玻璃试管中：
──200 L提取液(9.5.1或9.3.8)或尺度溶液(6.2.2)
──200 L放射配体事变液(6.3.4)
──400 L抗血清事变液(6.3.3)
在最后插手抗血清后开始恒温。
［留意：每个样品平行测定两次］
9.5.3 在+4℃中恒温留宿
9.5.4 在每个管内插手1mL经充实搅和的活性炭悬浮液必须在5分钟内完成。
9.5.5 在0℃中孵育30分钟
9.5.6 1700g 离心10min
9.5.7 将上清液移入至足够量的液闪液中.
9.5.8 在闪烁仪中计数10分钟或计数偏差在2%之内.
10.0 功效计较
10.1 要求校正曲线计较功效时回收非线性措施是相宜的。
[留意：在RIA中进校正氯霉素标样浓度和团结量/总量(B/T)之间别离为非线性最小二次方曲线拟合中的自变量和因变量.若B/T值经对数转换后，凡是只有校正曲线的中心部门呈线性。]
对付样品中氯霉素含量的计较，必要下列数据：
A 每个试管中氯霉素量(两次均匀值)，这些值是从校正曲线中测得的。
F 校正因子，移入RIA管中的检测样品钻的比值。
EA 从原提取样液中取出用于净化部门的样液重量。
EW 原提取液重量。
SW 样品重量。
蛋样品
F＝22.5，对付说明含量中10ppb时
EA=约为EW的六分之一，回收准确数值
EW=一样平常为5－6.5克，回收准确数值
SW=约为3克回收准确数值
肉样品
F＝22.5，对付说明其含量浓度为10ppb时
EA=约为EW的1/6回收准确数值
EW=一样平常为7.5－9克，回收准确数值
SW=约为3克回收准确数值
F=5，对付说明个中含量浓度为1ppb时
EA=约为1，对付说明含量在1ppb时
EW＝约为1，对付说明含量在1ppb时
SW＝约为1，对付说明含量在1ppb时。
功效计较式为：
A F EW
F = = ----------------------
1000 EA SW
10.2 慎密度
在EEC用肉和牛奶做协同试验测定功效如下：
肉 牛奶
现实含量( g/kg) 11.6 1.0
测得均匀值( g/kg) 6.9 1.1
一再性(ng/g) 3.2 0.72
CV%(变异系数) 16 23
重现性(ng/g) 7.0 1.1
变异系数cv% 36 36
尝试室间cv% 32 28
注1：这个数值未思量接纳率的校正。
本数据的说明凭证ISO尺度5725/1986举办。
10.3 质量节制
对下列每个说明工具必需一再检讨两次包罗：试剂空缺，动物组织空缺样品，用作添加的动物组织样，也许的话尚有参考物质（标样）。
应测定移入每个说明试管的总放射量。
应测定非特异性团结放射配体的量，其值不能高出8%，
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11 - 12 略
13. 样品格量节制
肌肉，牛奶和蛋的基准物质由BGA制备并按DG12测定和试验措施举办，最终彼此较量和认证。
14 - 15 略
16. 检讨流程图
肉/蛋----------------------------→溶剂提取
牛奶---→溶剂提取---→C18 SPE小柱--→RIA----→测定功效