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婴幼儿奶粉和米粉中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及其毒素基因检测

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    金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)是一种重要的食源性致病菌,在很多国家,它被认为是第二大食源性致病菌,仅次于沙门氏菌,占细菌性食物中毒的33%[1];该菌在加拿大引起食物中毒的发生率更高,占45%[2]。金黄色葡萄球菌在自然界很常见,在土壤、空气、动物及健康人群等均可存在。食品从农田到餐桌过程中均可能受到污染。婴儿食品如奶粉、米粉等食品的加工过程虽受到严格的控制,但还是可能会受到不同程度的污染,这些被金黄色葡萄球菌污染的食物,可能会引起婴儿对该菌的感染或食物中毒。
    金黄色葡萄球菌产生多种外毒素,主要有肠毒素(staphylococcal enterotoxins,Ses),剥脱毒素(exfoliativetoxins,Ets),中毒休克毒素-1(toxic-shock syndromet o x i n - 1 ,Ts s t - 1 ) 和杀白细胞素( p a t o n - v a l e n t i n eleukocidin,Pvl)等[3-7]。肠毒素是引起食物中毒的主要致病因子,除Sea、Seb、Sec 和Sed 这4 种早已被鉴定的血清型外,近几年还发现了See、Seg、Seh、Sei、Sej 等新型肠毒素[8-10]。剥脱毒素大约5% 的金黄色葡萄球菌产生,该毒素主要引起皮散热功能失调,最严重的是引起金黄色葡萄球菌散热性皮肤灼伤综合症,对婴幼儿和儿童危害严重[11-12]。中毒休克毒素-1 是中毒休克毒素中最重要的一种,它对女性危害严重,可产生高水平的抗体,从而引起局部或全身的中毒休克综合症[13]。大约5% 的金黄色葡萄球菌存在杀白细胞素,该毒素可引起皮肤、软组织感染和严重的坏死性肺炎[ 14]。
    近年来,国内外对鸡肉、猪肉、冰激凌、凉拌菜等各种食品中金黄色葡萄球菌污染状况和毒素基因携带情况有较多的调查报道,但国内外对婴幼儿奶粉和米粉中金黄色葡萄球菌的报道较少。奶粉和米粉已成为婴幼儿必备的辅助食物或主要食物,鉴于其原料的易污染性,婴幼儿食品中可能存在被金黄色葡萄球菌污染。本研究采用国标培养法和PCR 方法进行分离鉴定S. aureus及其毒素基因检测,初步了解婴幼儿奶粉和米粉中S .aureus 的流行状况及毒素基因分布情况,为婴幼儿食品的安全评估提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 培养基和主要试剂
    缓冲蛋白胨水(BPW)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、Barid-Parker 培养基(BP)、LB 营养琼脂 北京陆桥技术有限责任公司;Ta q DNA 聚合酶、dNTPs、20 00 bpDNA marker、引物 大连宝生物公司;琼脂糖(agarose)美国Sigma 公司;甘油、氯化钠 西安化学试剂厂。

1.2 样品采集及S. aureus 分离
    2010 年7、8 月采集陕西省18 个地区不同品牌的婴幼儿奶粉和米粉样品共计367 份,其中奶粉143 份、米粉224 份。依据GB/T 4789.10 — 2008《金黄色葡萄球菌检验》方法,取25g 奶粉或米粉样品接种于225mL 的BPW 培养基中,37℃培养24h,取增菌培养液3mL 接种于30mL 7.5% NaCl TSB 肉汤中,37℃培养24h。用棉签从增菌液中划到Baird-Parker Agar 平板中,37℃培养24 h,每个可疑样品挑取1 ~2 个菌落,进行纯化培养。nuc 基因的PCR 反应条件,参照文献[12]执行,最后取5μL PCR 产物进行电泳检测,进行S. aureus 确证。

1.3 基因组 DNA 的提取
    用棉签蘸取纯培养细菌,置入装有500μL 蒸馏水的离心管中,混匀。加热煮沸30min 后,13000r/min 离心5mi n ,取上清液。于- 3 0 ℃冰箱中保存备用。
1.4 PCR 扩增及引物设计
    按照Brakstad 等[15]的报道,执行nuc 基因的引物合成和扩增条件,以确定金黄色葡萄球菌。按照王琴等[16]报道执行pvl 基因引物合成和扩增条件。按照Peles 等[6]的报道执行s e s 和t s s t -1 引物合成和扩增条件。按照Noguchi 等[17]的报道执行剥落毒素基因(eta、etb 基因)引物合成和扩增条件。以上引物均由大连宝生物公司合成,引物序列及片段长度见表1 。
1.5 电泳
    PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶量为1%,利用标准大小的DNA Marker,观察电泳完成后的凝胶,并记录PCR 扩增的结果。

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作者:admin 来源:网络收集 发布时间:2016年05月09日
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