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Folin-Ciocalteu比色法应用于蔬菜和水果总多酚含量测定的研究

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【摘 要】目的 优化Folin-Ciocalteu 比色法测定总多酚含量的条件,应用该法在最适反应条件下测定22 种蔬菜和4 种水果中的总多酚含量。方法 以吸光度为评价指标,分别对样品中总多酚的浸提方法、测定波长、呈色反应体系中主要反应液的用量、显色温度、反应时间进行优化并逐一考察Folin-Ciocalteu 比色法的重复性、精密度、稳定性和加标回收率后,以没食子酸为标准品,在最适反应条件下对22 种蔬菜和4 种水果中的总多酚含量进行测定。结果 经过一系列优化试验,确定Folin-Ciocalteu 比色法的最佳反应条件为:以50%丙酮溶液为总多酚提取溶剂,Folin-Ciocalteu显色剂用量2ml,10%碳酸钠溶液用量10ml,显色温度50℃,反应时间1h,测定波长765nm。没食子酸标准品在质量浓度0~ 0.20 mg/ml 范围内与其吸光度呈良好线性关系(R2=0.9987),Folin-Ciocalteu 比色法重复性试验RSD 为3.89%,精密度试验RSD 为1.89%,稳定性试验RSD 为0.40%,平均回收率为102.12%,RSD 为1.27%。22 种蔬菜中豇豆总多酚含量最高(143.20mg/100g),西葫芦最低(10.54mg/100g),4 种水果中苹果总多酚含量较高(83.77mg/100g)。结论Folin-Ciocalteu 比色法在本研究建立的最适条件下显色灵敏、准确可靠、稳定性高、简便易行,适用于对蔬菜和水果总多酚进行含量测定。[营养学报,2011,33(3):302-307]
关键词: Folin-Ciocalteu 比色法; 总多酚; 蔬菜; 水果

【Abstract】 Objective To optimize the determining conditions of Folin-Ciocalteu colorimetry and apply them to determine the total polyphenols content in 22 kinds of vegetables and 4 kinds of fruits. Method Absorbency was adopted as evaluation index, and the extracting method of polyphenols, detecting wavelength, dosage of main reagents, reacting emperature and duration were optimized respectively. After repeatability, precision, stability and retrieving rate of Folin-Ciocalteu colorimetry were evaluated, it was used to determine total polyphenols content in vegetable and fruit specimens in optimal conditions, with gallic acid as reference. Results The optimal conditions of Folin-Ciocalteu (FC) colorimetry were established as follow:polyphenols extracted with 50% acetone, FC reagent 2 ml and 10% Na2CO3 10 ml,reacting temperature 50℃,reaction time 1h,and detecting wavelength 765nm. As for Folin-Ciocalteu colormietry,
concentration of gallic acid and its absorbency bear good linearity in the range of 0~0.20 mg/ml (R2=0.9987). The relative standard deviation of its repeatability test, precision test and stability test were 3.89%、1.89% and 0.40% respectively. Its average retrieving rate was 102.12% (RSD 1.27%). Among all the vegetables determined, cowpea contained the most polyphenols (143.20mg/100g), cucurbita pepo the least (10.54mg/100g). Apple exhibited relatively high polyphenols content among all fruits. Conclusion Folin-Ciocalteu colorimetry established in this study is simple, fast, highly sensitive and very stable. It is suitable to be applied to determine total polyphenols content in vegetables and fruits. [ACTA NUTRIMENTA

Key words:Folin-Ciocalteu colormietry; total polyphenols; vegetables; fruits

    植物多酚是天然抗氧化物中的一大类重要物质,水果、蔬菜、饮料如茶、红酒、咖啡是其主要来源 [1-3]。植物多酚具有很强的抗氧化和清除自由基活性,多应用于预防与治疗癌症、中风、冠心病和神经退行性疾病[4-6],同时它也是一类抗营养素物质,会阻碍膳食非血红素铁、钙等微量元素的吸收[7],可见植物多酚对人体健康的影主要决定于其来源食材中多酚的含量与食物摄入量。目前,国内关于食材中总多酚含量的报道很少,总多酚定量分析缺乏统一的方法,本研究选用了国内外文献报道中应用较多的Folin-Ciocalteu 比色法[8-11],然而关于Folin-Ciocalteu 法条件的研究较少,并且文献中采用的比色条件差异较大[11-18],如所用碱液的浓度、用量差异很大,显色时间从30 min 到150min 不等,因此,本研究对样品中总多酚的浸提方法和影响含量测定结果的反应条件逐一进行观察,确定最佳反应体系,并在系统的方法学评价基础上,应用该法对收集于河南省南阳市的26 种蔬菜和水果样品进行了总多酚的定量测定。

1 材 料 与 方 法
1.1 样品、试剂与仪器
    样品:辣椒(青、尖)、黄瓜(夏)、番茄(西红柿)、马铃薯、甘薯(红)、四季豆、豇豆、黄豆芽、芹菜(茎、叶)、韭菜、生菜、蒜苗、西葫芦、包心菜(绿)、大白菜(白口)、茄子(紫皮、圆)、苤蓝(白)、白萝卜(长)、胡萝卜、洋葱(紫皮)、大葱、大蒜(白皮)、苹果1(青香蕉)、梨(鸭梨)、香蕉、香瓜,产地河南省南阳市高庙乡。苹果2(红福士,购自南阳市市场)。
    试剂:没食子酸标准品(纯度≥98%,购自Sigma-Aldrich 公司)、钨酸钠、钼酸钠、浓磷酸、浓盐酸、硫酸锂、溴水、碳酸钠、丙酮均为国产分析纯试剂。
    Folin-Ciocalteu 试剂(下文简称FC 试剂):于1000ml 磨口回流装置内加入钨酸钠50 g,钼酸钠12.5 g,蒸馏水350 ml,浓磷酸(14 mol/L)25 ml,浓盐酸(12 mol/L)50 ml,充分混匀,微沸回流10 h,称取一水合硫酸锂(Li2SO4·H2O)87.29g,少量多次加入到圆底烧瓶内,滴加溴水数滴,开口沸腾,使溴水完全挥发为止,冷却,定容至500ml,过滤,置棕色瓶中保存备用,使用时用1 倍蒸馏水稀释[12]。
    仪器:7230G 型可见分光光度计(上海菁华科技仪器公司);K-Q-500B 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器公司);101 型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂);FA2104 型电子分析天平(上海恒平科学公司)。

1.2 方法
1.2.1 Folin-Ciocalteu 比色法试验方法:在含有酚类物质的待测试样中加入一定量的FC 试剂和一定量的10%碳酸钠溶液,定容至25 ml,在一定温度下避光反应一定时间,以蒸馏水为空白,测定试样液体的吸光度值(absorbency,A),依据没食子酸标准工作曲线的拟合方程,计算试样中的总多酚含量[13]。
1.2.2 没食子酸标准品溶剂和测定波长的确定:精确称取20 mg 干燥没食子酸标准品2 份,分别以蒸馏水和80%丙酮为溶剂,30℃超声至完全溶解后定容至100 ml,配制成0.2 mg/ml 的标准溶液,吸取1 ml 分别加入FC 试剂2 ml,10%碳酸钠溶液10ml,定容至25ml,40℃避光反应1.5h,以蒸馏水为空白,分别于730、760、765 nm 处测定吸光度值[12,14,15]。
1.2.3 显色条件的确定[14-18]:(1)显色温度的确定:以1.2.2 试验结果确定的溶剂配制0.2 mg/ml的没食子酸标准溶液,取6 份,每份1ml,按照
1.2.1 所述试验方法,固定其他试验条件(FC 试剂2ml,10%碳酸钠溶液10ml,避光反应1.5h),分别在20、30、40、50、60、70℃下反应,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值,以比较不同反应温度对吸光度的影响。(2)显色时间的确定:同上取没食子酸标准溶液6 份,每份1ml,按照1.2.1 所述试验方法,固定其他试验条件(FC试剂2ml,10%碳酸钠溶液10ml,40℃,避光),分别反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h,于
1.2.2 试验结果确定的波长处测定吸光度值,以比较不同显色时间对吸光度的影响。(3)FC 试剂用量的确定:同上取没食子酸标准溶液6 份,每份1ml,按照1.2.1 所述试验方法,固定其他试验条件(10%碳酸钠溶液10 ml,于40℃避光反应1.5 h),分别加入FC 试剂0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml,于1.2.2 试验结果确定的波长处测定吸光度值,以比较FC 试剂用量对吸光度的影响。(4)10%碳酸钠溶液用量的确定:同上取没食子酸标准溶液6 份,每份1ml,按照1.2.1 所述试验方法,固定其他试验条件(FC 试剂2ml, 40℃避光反应1.5h),分别加入10%碳酸钠溶液1、2、4、6、8、10ml,于1.2.2 试验结果确定的波长处测定吸光度值以比较10%碳酸钠溶液用量对吸光度的影响。

1.2.6 Folin-Ciocalteu 比色法方法学评价:(1)重复性试验:从一批苹果样品中随机抽取6个,分别取可食部100g,加入蒸馏水100ml,制为匀浆,取匀浆10ml,按照1.2.5 试验结果确定的方法提取苹果总多酚,按照1.2.1 试验方法和1.2.3 试验结果确定的最佳反应条件进行显色反应,于1.2.2 试验结果确定的波长处测定吸光度值,计算相对标准偏差(RSD),以评价该方法的重复性。(2)精密度试验:按上述样品前处理、总多酚制备和测定方法对同一苹果待测样品平行测定6 次,计算相对标准偏差,以评价该方法的精密度。(3)稳定性试验:取苹果待测样品1份,按照上述总多酚制备和测定方法,分别在工作液显色完全后的10、20、30、40、50、60 min测定吸光度值,计算相对标准偏差,以评价该方法的稳定性。(4)加标回收率试验:向已知总多酚含量的苹果待测样品中分别加入300、500、700μl 的没食子酸标准溶液,测定并计算总多酚的回收率及相对标准偏差,以评价该方法的准确性和可靠性。
1.2.7 样品中总酚含量的测定:取待测蔬菜和水果样品(每种取2 份平行)可食部100g,加入蒸馏水100ml,制备匀浆后称取10g,按照1.2.5试验中确定的提取方法制备样品总多酚后吸取滤液1ml,按照1.2.1 试验方法和1.2.3 试验结果确定的反应条件进行显色反应,于1.2.2 试验结果确定的波长处测定吸光度值并计算样品中总酚含量。

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作者:admin 来源:网络收集 发布时间:2016年04月28日