1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。2 设备和材料
2.1 吸管:1mL具0.1mL刻度；5mL和10mL具1mL刻度。
2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃44.5±0.5℃。
2.4 冰箱:0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6 乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8 天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。3 培养基及试剂
3.1 月桂基**盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂（EMB）。
3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15Voges-proskauer（V-P）试剂。4 样品制备
4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备
4.2.1 液体食品
以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇）制成1:10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品
以无菌操作取25g样品放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内于8000r/min均质1～2min制成1:10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕全过程不得超过15min。5 大肠菌群的测定
5.1 大肠菌群MPN值的测定
5.1.1 对每个样品选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基**盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者则进一步作证实试验。5.2 大肠菌群的证实试验
5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数查MPN表[见附录B（补充件）]报告每克（毫升）样
品中大肠菌群的MPN值。6 粪大肠菌群测定
6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：按产气管数查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。7 大肠杆菌测定
7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板36±1℃培养24±2h。
7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位移种到营养琼脂斜面上36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶振摇试管后静置2h如出现伊红色为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色为甲基红试验阳性若变黄色则为阴性反应。
7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4LST肉汤：于36±1℃培养48±2h观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
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靛基质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐┃鉴定（型别）
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃典型大肠杆菌
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃非典型大肠杆菌
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃典型中间型
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃非典型中间型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
－ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型产气肠杆菌
＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃非典型产气肠杆菌
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如出现上表以外的生化反应类型表明培养物可能不纯应重新划线分离必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌发酵乳糖产酸产气IMViC试验为＋＋--或－＋--再根据LST肉汤阳性管数查MPN表报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN值。8 大肠菌群固体培养基测定法
8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数
8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液每个稀释度接种两个灭菌平皿每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板置于36±1℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实
8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落移种于BGLB肉汤管内36±1℃培养24h和48h观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管应进行革兰氏染色以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告
经最后证实为阳性（产气革兰氏阴性杆菌）的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数再乘以稀释倍数即为每克（毫升）样品中大肠菌群数。
例：10**-4样品稀释液1mL在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落挑取其中10个接
种BGLB肉汤管证实有6个阳性管则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×10**4/g（mL）＝6.0×10**5/g（mL）
附 录A
培养基和试剂
（补充件）
A1 月桂基**盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤
胰蛋白（月示）或胰酪胨（Trypticase）20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75g
月桂基**钠 0.1g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。A2 煌绿乳糖胆盐（BGAB）肉汤
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200.0mL
0.1％煌绿水溶液 13.3mL
蒸馏水 1000.0mL
将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中pH7.0～7.5）用蒸馏水稀释到975mL调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL用蒸馏水补足到1000mL用棉花过滤后分装到20mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管）中每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。A3EC肉汤
胰蛋白（月示）或胰酪（月示） 20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 4.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将以上成分溶解于蒸馏水中分装16mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管）每管8mL。121℃高压灭菌15min最终pH6.9±0.1。A4 伊红美蓝琼脂（EMB）
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.0g
琼脂 15.0g
伊红γ（水溶性） 0.4g或2％水溶液20mL
美蓝 0.065g或0.5％水溶液13mL
蒸馏水 1000.0mL
在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液摇匀冷至45～50℃倾注平皿。A5 营养琼脂斜面
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分加于蒸馏水中煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。A６ 色氨酸肉汤
胰胨或胰酪胨 10.0g
蒸馏水 1000.0mL
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。A7MR-VP培养基
（月示）胨 7.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶于蒸馏水中分装试管121℃高压灭菌15min最终pH6.9±0.2。A8Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O） 1.5g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.0g
**镁（MgSO4·7H2O） 0.2g
枸椽酸钠（含2H2O） 3.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中分装试管每管10mL121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。A9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性红 0.03g
结晶紫 0.002g
琼脂 15～18g
蒸馏水 1000.0mL
将上述成分溶于蒸馏水中静置几分钟充分搅拌调至pH7.4±0.1。煮沸2min将培养基冷至45～50℃倾注平板。临用时制备不得超过3h。A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
贮存液
磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0g
蒸馏水 500mL
将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中用1mol/L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。
稀释液
取贮存液1.25mL用蒸馏水稀释至1000mL分装于合适容器后121℃高压灭菌15min。A11生理盐水
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000.0mL
将氯化钠溶于蒸馏水中121℃高压灭菌15min。A12革兰氏染色液
结晶紫染色液：
结晶紫 1.0g
95％乙醇 20.0mL
1％草酸铵水溶液 80.0mL
将结晶紫完全溶解于乙醇中然后与草酸铵溶液混合。
革兰氏碘液：
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水 300.0mL
将碘与碘化钾先行混合加入蒸馏水少许充分振摇待完全溶解后再加蒸馏水至300mL。
沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95％乙醇 10.0mL
蒸馏水 90.0mL
将沙黄溶解于乙醇中然后用蒸馏水稀释。
染色法
a.将涂片在火焰上固定滴加结晶紫染液染1min水洗。
b. 滴加革兰氏碘液作用1min水洗。
c.滴加95％乙醇脱色约15～30s直至染色液被洗掉不要过分脱色水洗。
d. 滴加复染液复染1min水洗、待干、镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈紫色革兰氏阴性菌呈红色。A13Kovacs氏靛基质试剂
对二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇 75.0mL
盐酸（浓） 25.0mL
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中然后慢慢加入浓盐酸即可。A14甲基红指示剂
甲基红 0.1g
95％乙醇 300mL
将甲基红溶解于300mL乙醇中加水稀释至500mL。A15Voges-Proskauer（V-P）试剂
甲液
α-萘酚 5.0g
无水乙醇 100.0mL
乙液
氢氧化钾 40.0g
用蒸馏水加至 100.0mL
附 录B
1g检样中最近似值（MPN）表
（补充件）
使用三管法接种量分别为0.10.01和0.001g。
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阳性管数 ┃ ┃ 阳性管数 ┃
━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫MPN
0.10.010.001 ┃ ｜0.10.010.001 ┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
0 0 0 ┃＜3 ┃ 2 0 0 ┃9.1
0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃14
0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃20
0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃26
0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃15
0 1 1 ┃ 6.1┃ 2 1 1 ┃20
0 1 2 ┃ 9.2┃ 2 1 2 ┃27
0 1 3 ┃ 12┃ 2 1 3 ┃34
0 2 0 ┃ 6.2┃ 2 2 0 ┃21
0 2 1 ┃ 9.3┃ 2 2 1 ┃28
0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃35
0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃42
0 3 0 ┃ 9.4┃ 2 3 0 ┃29
0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃36
0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃44
0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃53
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
1 0 0 ┃ 3.6┃ 3 0 0 ┃23
1 0 1 ┃ 7.2┃ 3 0 1 ┃39
1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃64
1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃95
1 1 0 ┃ 7.3┃ 3 1 0 ┃43
1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃75
1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃120
1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃160
1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃93
1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃150
1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃210
1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃290
1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃240
1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃460
1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃1100
1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100
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注:①本表采用3个稀释度[0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）]每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）时表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）和0.0001g（mL）时则表内数字应相应增加10倍其余类推。
相关标准：GB 8537-2008 饮用天然矿泉水
GB 7718-2011 食品安全国家标准 预包装食品标签通则