1 媒介
“皮革奶”添加物的首要因素是皮革水解卵白（即动物皮毛，含大量角质卵白质），个中劣质水解卵白的出产质料首要来廉价革工场的边角废物，制革边角废物中含有重铬酸钾和重铬酸钠，用这种质料出产水解卵白，重铬酸钾和重铬酸钠天然就被带入产物中，被人体接收。食物专家先容，皮革水解物首要添加的食物是乳与乳成品及含乳饮料，浸染是增进卵白质含量。 首要检测要领是搜查牛奶中是否含有L-羟脯氨酸，这是动物胶原卵白中的特怀孕分，在乳酪卵白中则没有，以是一旦验出，则可以为含有皮革水解卵白。 本尝试提供了乳成品中L-羟脯氨酸的检测要领，回收DNFB柱前衍生法举办说明测定。
2 仪器设置与试剂 2.1 仪器、前处理赏罚装备及试剂盒设置
表1 L-羟脯氨酸检测尺度设置 序号 名称 订货号
1 P1201 高压二元梯度体系
2 氨基酸说明专用色谱柱 31110091
3 氨基酸专用掩护柱
4 氨基酸试剂盒 31990001
5 L-羟脯氨酸尺度品
表2 氨基酸试剂盒组分表
序号 名称
1 氨基酸衍生化溶液
2 衍生缓冲固体组分A
3 衍生缓冲固体组分B
4 均衡缓冲固体组分A
5 均衡缓冲固体组分B
6 活动相B固体组分
表3 前处理赏罚装备设置
序号 名称
1 恒温水浴锅
2 氮吹仪
3 溶剂过滤装置
4 活动相超声装置
5 烘箱
6 0.45μm针孔式微孔滤膜
7 5mL水解用安瓿瓶
8 封口膜
2.2 其他
25mL棕色容量瓶、50mL棕色容量瓶、移液枪、移液枪枪头、一次性PVC手套、一次性口罩、氮气瓶、2mL塑料离心管、进样针等。
2.3 试剂及相干溶液配制 2.3.1 衍生缓冲溶液
称取衍生缓冲液固体组分A 1.24g，固体组分B 7.63g，插手至500mL量瓶中，定容并摇匀后备用。
2.3.2 均衡缓冲溶液
称取均衡缓冲液固体组分A 0.91g，固体组分B 3.58g，插手至250mL量瓶中，定容并摇匀后备用。
2.3.3 羟脯氨酸尺度溶液
将羟脯氨酸尺度品用衍生缓冲溶液定容至250mL容量瓶中，备用。
2.3.4 活动相A
乙腈-水（1:1），沟通体积的乙腈与水殽杂，超声脱气10～15min。
2.3.5活动相B
称取活动相B 固体因素4.1g加水约950mL，用冰醋酸调pH至6.4~6.8，加10mL NN-二甲基甲酰胺，加水定容至1000mL，摇匀后静置半晌，用0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气10～15min。
3 尝试要领 3.1 样品水解
精确称取适量样品于5mL安瓿瓶中，准确到0.0001g(使试样中卵白质含量在10～20mg范畴内)，插手3mL 6mol/L盐酸。含水量高的样品如牛奶，可插手等体积的浓盐酸。酒精灯高温拉丝封口放入烘箱中110℃ 水解24h。水解液氮气吹干，用衍生缓冲溶液多次洗涤安瓿瓶，归并洗涤液转移至25mL容量瓶中，并用衍生缓冲溶液定容，备用。
3.2 衍生要领 3.2.1 样品水解液衍生
取已过滤的样品液10mL至50mL棕色试剂瓶中，插手衍生试剂5mL，混匀。放入60℃水浴中，暗处回响60min。 回响完毕，取出冷却至室温，插手均衡缓冲溶液稀释到刻度，静置15min，用0.45μm滤膜过滤，取10μL进样说明。
3.2.2 L-羟脯氨酸尺度溶液衍生
移取10.0mL L-羟脯氨酸溶液，插手50mL棕色容量瓶中，再插手5.0mL衍生化溶液。用封口膜封口，放入60℃水浴中，暗处回响60min。取出，冷却至室温，用均衡缓冲溶液稀释至刻度。静置15min，取10μL进样说明。
3.3 色谱前提
色谱柱为依利特公司氨基酸说明专用ODS色谱柱；柱温：27℃；回收二元梯度说明，梯度措施如表1所示；活动相总流量为1.2mL/min；检测波长：360nm；进样体积：10μL。 表1 梯度曲线
时刻(min) 活动相A(%) 活动相B(%)
0 16 84
0.3 16 84
4 31 69
9.5 36 64
17 55 45
28 65 35
34 100 0
36 100 0
38 16 84
4 疏散谱图
图1 19
氨基酸尺度品典范疏散谱图 1. Asp 天冬氨酸； 2. Glu 谷氨酸； 3. Hpy 羟脯氨酸；4. Ser 丝氨酸； 5. DNP-OH 24-二硝基苯酚； 6. Arg 精氨酸； 7. Gly 甘氨酸； 8. Thr 苏氨酸； 9.Pro 脯氨酸； 10. Ala 丙氨酸； 11. Val 缬氨酸； 12. Met 蛋氨酸； 13.Cys 半胱氨酸； 14. Ile 异亮氨酸； 15. Leu
图2 20μg/mL L-羟脯氨酸尺度品色谱图 亮氨酸； 16. Trp 色酸； 17. Phe 苯丙氨酸； 18. His 组氨酸； 19. DNFB 24-二硝基苯；20. Lys 赖氨酸；21. Tyr 酪氨酸
图3 奶粉样品色谱图
图4 奶粉中添加20μg/mL L-羟脯氨酸色谱图
图5 牛奶样品色谱图
图6 牛奶中添加20μg/mL L-羟脯氨酸色谱