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乳成品中L-羟脯氨酸的检测

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  1 媒介

   “皮革奶”添加物的首要因素是皮革水解卵白(即动物皮毛,含大量角质卵白质),个中劣质水解卵白的出产质料首要来廉价革工场的边角废物,制革边角废物中含有重铬酸钾和重铬酸钠,用这种质料出产水解卵白,重铬酸钾和重铬酸钠天然就被带入产物中,被人体接收。食物专家先容,皮革水解物首要添加的食物是乳与乳成品及含乳饮料,浸染是增进卵白质含量。     首要检测要领是搜查牛奶中是否含有L-羟脯氨酸,这是动物胶原卵白中的特怀孕分,在乳酪卵白中则没有,以是一旦验出,则可以为含有皮革水解卵白。     本尝试提供了乳成品中L-羟脯氨酸的检测要领,回收DNFB柱前衍生法举办说明测定。

 

2  仪器设置与试剂 2.1 仪器、前处理赏罚装备及试剂盒设置

表1  L-羟脯氨酸检测尺度设置  序号 名称 订货号

1 P1201 高压二元梯度体系  

2 氨基酸说明专用色谱柱 31110091

3 氨基酸专用掩护柱  

4 氨基酸试剂盒 31990001

5 L-羟脯氨酸尺度品  

      表2 氨基酸试剂盒组分表 

序号 名称

1 氨基酸衍生化溶液

2 衍生缓冲固体组分A

3 衍生缓冲固体组分B

4 均衡缓冲固体组分A

5 均衡缓冲固体组分B

6 活动相B固体组分

  表3  前处理赏罚装备设置 

序号 名称

1 恒温水浴锅

2 氮吹仪

3 溶剂过滤装置

4 活动相超声装置

5 烘箱

6 0.45μm针孔式微孔滤膜

7 5mL水解用安瓿瓶

8 封口膜

 

2.2 其他

    25mL棕色容量瓶、50mL棕色容量瓶、移液枪、移液枪枪头、一次性PVC手套、一次性口罩、氮气瓶、2mL塑料离心管、进样针等。

2.3 试剂及相干溶液配制 2.3.1 衍生缓冲溶液

    称取衍生缓冲液固体组分A 1.24g,固体组分B 7.63g,插手至500mL量瓶中,定容并摇匀后备用。

2.3.2 均衡缓冲溶液

    称取均衡缓冲液固体组分A 0.91g,固体组分B 3.58g,插手至250mL量瓶中,定容并摇匀后备用。

2.3.3 羟脯氨酸尺度溶液

    将羟脯氨酸尺度品用衍生缓冲溶液定容至250mL容量瓶中,备用。

2.3.4 活动相A

    乙腈-水(1:1),沟通体积的乙腈与水殽杂,超声脱气10~15min。

2.3.5活动相B

    称取活动相B 固体因素4.1g加水约950mL,用冰醋酸调pH至6.4~6.8,加10mL N,N-二甲基甲酰胺,加水定容至1000mL,摇匀后静置半晌,用0.45μm微孔滤膜过滤,超声脱气10~15min。

3  尝试要领 3.1  样品水解

    精确称取适量样品于5mL安瓿瓶中,准确到0.0001g(使试样中卵白质含量在10~20mg范畴内),插手3mL 6mol/L盐酸。含水量高的样品如牛奶,可插手等体积的浓盐酸。酒精灯高温拉丝封口,放入烘箱中110℃ 水解24h。水解液氮气吹干,用衍生缓冲溶液多次洗涤安瓿瓶,归并洗涤液转移至25mL容量瓶中,并用衍生缓冲溶液定容,备用。

3.2  衍生要领 3.2.1  样品水解液衍生

    取已过滤的样品液10mL至50mL棕色试剂瓶中,插手衍生试剂5mL,混匀。放入60℃水浴中,暗处回响60min。 回响完毕,取出冷却至室温,插手均衡缓冲溶液稀释到刻度,静置15min,用0.45μm滤膜过滤,取10μL进样说明。

3.2.2  L-羟脯氨酸尺度溶液衍生

    移取10.0mL L-羟脯氨酸溶液,插手50mL棕色容量瓶中,再插手5.0mL衍生化溶液。用封口膜封口,放入60℃水浴中,暗处回响60min。取出,冷却至室温,用均衡缓冲溶液稀释至刻度。静置15min,取10μL进样说明。

3.3  色谱前提

    色谱柱为依利特公司氨基酸说明专用ODS色谱柱;柱温:27℃;回收二元梯度说明,梯度措施如表1所示;活动相总流量为1.2mL/min;检测波长:360nm;进样体积:10μL。 表1  梯度曲线

时刻(min) 活动相A(%) 活动相B(%)

0 16 84

0.3 16 84

4 31 69

9.5 36 64

17 55 45

28 65 35

34 100 0

36 100 0

38 16 84

  4 疏散谱图                               

 

 

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        图1 19

 

氨基酸尺度品典范疏散谱图 1. Asp 天冬氨酸; 2. Glu 谷氨酸; 3. Hpy 羟脯氨酸;4. Ser 丝氨酸; 5. DNP-OH 2,4-二硝基苯酚; 6. Arg 精氨酸; 7. Gly 甘氨酸; 8. Thr 苏氨酸; 9.Pro 脯氨酸; 10. Ala 丙氨酸; 11. Val 缬氨酸; 12. Met 蛋氨酸; 13.Cys 半胱氨酸; 14. Ile 异亮氨酸; 15. Leu

 

 

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   图2  20μg/mL L-羟脯氨酸尺度品色谱图 亮氨酸; 16. Trp 色酸; 17. Phe 苯丙氨酸; 18. His 组氨酸; 19. DNFB 2,4-二硝基苯;20. Lys 赖氨酸;21. Tyr 酪氨酸

 

 

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图3  奶粉样品色谱图

 

 

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图4  奶粉中添加20μg/mL L-羟脯氨酸色谱图

 

 

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图5  牛奶样品色谱图

 

 

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图6  牛奶中添加20μg/mL L-羟脯氨酸色谱


作者:admin 来源:网络收集 发布时间:2016年02月25日