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GC/MS法测定牛肝、肾和肉中 -感动剂的三甲基硅烷衍生物(EEC,筛选法)

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GC/MS法测定牛肝、肾和肉中 -感动剂的三甲基硅烷衍生物(EEC,筛选法)


β-Agonists-A Screening Method for the Detection ofβ-Agonists in Bovine Liver,Kidney and Meat by GC-MS in the ElectronImpact Mode for the Trimethylsilyl derivatives
(EEC, Screening Method Sg2.4)

1 主题内容
这是一种多残留说明要领,描写了残留于小牛和成年牛的肝、肾和肉的样品中,12种单体 -感动剂测定要领。该要领是法兰西的官方要领,与欧共体残留导则(86/469/EEC)的原则保持同等。

2 应用范畴
该要领用于一般筛选说明小牛和成年牛的肝、肾和肉样品,测定样品中的clenbuterol, clenpenterol, hydroxymethyl-clenbuterol, salbutamol, terbutaline, cimaterol, cimbuterol, mabuterol, mapenterol, tulobuterol, fenoterol和ractopamine等 -感动剂的残留量。要领的检出限被界说为当信躁比 3时,大大都 -感动剂的检出低于2 g/kg。

3 参考资料(略)

4 界说
-感动剂的含量是指被测定样品中 -感动剂的物质的量,按照以上对本要领所作的描写,它应该表述为 g/kg样品(肝、肾和肉)。

5 要领道理
本要领由8个部门构成。
⑴ 样品用Stomacher均质器和超声波装备均质。
⑵ 共轭物的水解。
⑶ 酸沉淀。
⑷ 液液萃取。
⑸ 用殽杂固相色谱提取法对萃取溶液举办净化和浓缩。
⑹ 衍生回响。
⑺ 用GC-MS电子轰击源举办测定。
⑻ 功效的计较和评价。

6 尝试原料
留意:回响试剂(包罗仪器装备)的来历都应该切合要求,不外差异来历的试剂和装备可以等同行使。所有试剂都必需说明纯或高于说明纯。
6.1 尺度品
氯化克喘素
Salbutamol hemisulphate, Terbutaline hemisulphate,metoprolol tartrate。
Cimaterol, Clenpenterol(NBA 760), mabuterol, fenoterol hydrobromide ,hydroxymethyl clenbuterol(NA1141)(Boehringer Ingleheim公司)。
Tulobuterol hydrochloride(Abbott公司)。
Ractopamine hydrochloride(Eli Lilly公司)。
Cimbuterol,marpenterol 由法兰西Rennes大学化学系合成。
6.2 化学药品和试剂
6.2.1 Helix pomatia果汁( -glucuronidase-arylsulfatase, Merck-4114)。
6.2.2 冰乙酸
6.2.3 超纯水: 14 M .cm。
6.2.4 甲醇
6.2.5 乙酸乙酯
6.2.6 32 的氢氧化铵
6.2.7 1 mol/L氢氧化钾
6.2.8 1 mol/L乙酸
6.2.9 N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)(Regisil-270111或FLUKA-15244)。
6.2.10 甲苯分子筛
6.2.11 乙酸钠
6.2.12 磷酸二氢钾
6.2.13 氮气:通过硅胶干燥
6.2.14 高纯氦气
6.2.15 70 高氯酸
6.2.16 氯化钠
6.2.17 异丙醇
6.2.18 氮气
6.3 溶液
6.3.1 -感动剂:以甲醇为溶剂制备尺度储蓄溶液,浓度别离为1g/L和100 mg/L(6.1.1),在-18℃贮存。
6.3.2 -感动剂:以甲醇为溶剂稀释尺度储蓄溶液(6.3.1)以制备尺度事变溶液,浓度别离为10 g/mL和1 g/mL,在-18℃贮存于黑漆黑。
6.3.3 0.2mol/L pH=5.2乙酸钠缓冲溶液,用于共轭物的水解。制备操纵为消融16.4g乙酸钠(6.2.11)于900mL水中(6.2.3)用冰乙酸(6.2.2)调理pH到5.2 0.1,最后用水稀释到1L,在+4℃贮存,行使期为1个月。
6.3.4 pH=6,0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。消融13.6 0.1g磷酸二氢钾(6.2.12)于900mL水中(6.2.3),用1mol/L的氢氧化钾(6.2.7)调理pH值到6.0 0.1,最后用水稀释到1L,在+4℃贮存,行使期为1个月。
6.3.5 以97﹕3(v/v)殽杂乙酸乙酯和32 的氢氧化铵。每100mL可做16个样品。行使前搅拌或动摇,而且在后头的9.13.3步操纵时代,同时接管超声波水浴的处理赏罚。
6.3.6 0.1 mol/L高氯酸(PCA)沉淀剂:用水稀释8.6mL 70 高氯酸到体积为1升。
6.3.7 1 mol/L乙酸:用100 mL水稀释5.6 mL的冰乙酸(6.2.2)。
6.3.8 体积比为40:60的异丙醇和乙酸乙酯殽杂溶液:殽杂400 mL的异丙醇和600 mL的乙酸乙酯。

7 仪器装备
7.1 离心机。
7.2 旋转蒸发器。
7.3 程度振荡器。
7.4 Stomacher(Cofralab-07555526)和塑料袋(Cofralab-07556952)。
7.5 超声波水浴。
7.6 搅拌机或碎肉机。
7.7 真空过滤体系(Vac-Elut from Analytichem International)。
7.8 超声波探头(Cofralab-07580740)。
7.9 磁搅拌器或磁振荡器。
7.10 衍生回响用的圆锥型回响小玻璃瓶 。
7.11 加热圆锥型回响小玻璃瓶(7.10)用的加热块。
7.12 配有吹氮气装置的旋转蒸发体系。
7.13 固相提取柱(SPE-柱):CLEAN SCREEN DAU IM6(Worldwide monitoring - Horsham, PA, USA and sold by Technicol, Stockport, Cheshire, UK)。这些柱子含有1000 mg的殽杂相担体,具有憎水性和离子互换的性子。
7.14 GC-MS。
7.14.1 气相色谱仪:HP 5890。
毛细管色谱柱:30 m 0.25 mm内径,具有0.25 m膜厚的SE-30牢靠相。
进样模式:不分流进样高出1min。
进样体积:2 L。
进样器温度:250℃;接口温度:280℃。
升温措施:
70℃(2min) 18℃/min 200℃(0min) 5℃/min 245℃(0min)25℃/min 300℃(12 min)
载气:高纯氦,流量1 mL/min;压力5 psi。
7.14.2 质谱仪(MS):HP 5971,具有UNIX计较机事变站。
电子轰击离解模式:70 eV。
离子源温度:190℃ 5℃。
离子源真空度:30-40毫乇。
离子质量:见表1。

表 1
-感动剂的名称 N RT(分) 选择离子 分子离子
Tulobuterol 1 9.34 86,194,284 299
Mabuterol 1 10.36 86,277,296 382
Mapenterol 1 11.04 100,277,296 396
Terbutaline 3 11.67 86,356 441
Clenbuterol 1 12.02 86,243,262(264) 348
Cimaterol 1 12.14 72,219 291
Salbutamol 3 12.27 85,369 455
Cimbuterol 1 12.36 72,291 305
Cimaterol 2 12.62 27,223 363
Metoprolol(I.S) 1 12.7 86,291 339
Cimbuterol 2 12.8 100,243,262(264) 377
Clenpenterol 1 12.86 174,243,262 362
Hydroxymethyl-
clenbuterol(NA
1141) 2 14.05 322,256,412 436
Fenoterol 4 18.39 250,267 591
Ractopamine 3 18.63 517
表中的N代表三甲基硅烷基的数量,RT是在LDH,Nantes所做的一次说明中记录
到保存时刻。
 

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8 样品和取样措施
留意:寄望6.3.1节和国际尺度化组织文件78/2-1982(E)以及由文件2052/Ⅵ/84-EN 的附件Ⅱ导出的下列通则。
8.1 样品性状:即必需切合导则64/433/EEC中界说的内容,使可以或许举办肝、肾和肉样中残留物的测定。
8.2 样品量:样品量要大到足以完成测定以及一再测定的要求。本要领测定β-感动素作一次测按时所要求的样品量为10g。
8.3 样品收罗和包装的要领:必需使尝试室易于辨别和行使。
8.4 样品的包装、贮存和运输的要领:必需担保样品的完备性,不能影响测试的功效。
在48小时内就做 -感动素说明的样品,必需贮存于冰箱内。48小时往后才做说明的样品,必需在低于-18℃的温度下贮存。

9 操纵步调
9.1 支解约15g的低级样品,放进一台搅拌机或碎肉机中,使样品绞碎。但对肝样品来说,可不必这样做。
9.2 称出10 1 g的碎样,放入一个Stomacher口袋中,加进去15 mL pH=5.2的乙酸盐缓冲溶液(6.3.3),均质5分钟。
9.3 将袋中内容物转移到一个25 mL的烧瓶中。
9.4 将超声波探头(7.8)伸进烧瓶中,超声0.5秒钟,守候5秒钟后再超声0.5秒钟。对肝和肾样品一再这一操纵10次(总时刻为50秒),对肉样品一再这一操纵20次(总时刻为100秒)。
9.5 添加120 ng的metoprolol作为内标物质插手肝、肾和肉样中,包罗空缺的肝、肾和肉的样品,含量相等于12 g/kg样品。
9.7 取出一个肝、肾和肉的空缺样品,添加120ng的metoprolol尺度物质(相等于样品中含量为12 ppb),80 ng的tulobuterol, fenoterol, 和ractopamine尺度物质(相等于样品中含量为8 ppb),40 ng的其余 -感动剂尺度物质(相等于样品中含量为4 ppb)。
9.8 加50 L的Helix pomatia果汁(6.2.1),安排于50℃(42 52℃)的水浴中或烘箱内,安排留宿。
9.9 将颠末水解的肝、肾和肉样品转移到一个聚乙烯离心管中。
9.10 插手10 mL 0.1 mol/L的高氯酸(6.3.6),殽杂匀称并用70 的高氯酸(PCA)(6.3.15)调理pH值到1 0.3。
9.11 以7000转/分的转速离心25分钟后,将上清液转移到一根玻璃离心管中。
9.12 用氢氧化铵溶液(6.2.6)调理pH值到9.5 0.3。
9.13 用氯化钠饱和水相。
9.14 加25 mL 的异丙醇和乙酸乙酯的殽杂溶液(6.3.8),置于一个程度振荡器上振荡15分钟。
9.15 以3000-4000转/分的转速离心15分钟。
9.16 转移有机相到一个250 mL的旋转蒸发热瓶中。
9.17 再用15 mL的异丙醇和乙酸乙酯的殽杂溶液(6.3.8),提取水相一次,归并有机相。
9.18 在一个旋转蒸发器上,以45 5℃的温度,蒸发有机相至干。
9.19 以8 mL的磷酸盐缓冲溶液(6.3.4)使蒸发残渣成为悬浮液后,转移到一根溶血用的试管中,再用 4 mL的磷酸盐缓冲溶液洗涤烧瓶后,并入适才的溶血用的试管中。
9.20 以2000-3000转/分的转速离心15分钟。
留意:这一步操纵是很重要的,当旋转蒸发操纵之后呈现了固体残渣时。
9.21 将液相倾入一根试管中,再插手3mL磷酸盐缓冲溶液(6.3.4)。
9.22 固相提取(SPE)柱提取。
9.22.1 将色谱柱至于一种真空洗脱体系之上,别离用4mL甲醇,4mL水(6.2.3)和4mL磷酸缓冲溶液(6.3.4)依此洗涤柱子。
9.22.2 用巴氏消毒的移液管,将清澈的提取溶液转移至色谱住的顶部,轻微施加一点负压(约为5cm Hg柱)警惕迟钝地抽吸色谱柱。此步操纵至少必要10 分钟。
9.22.3 用40 cm Hg柱的负压,2 mL 1M的乙酸(6.2.8)洗涤柱子到干后至少15分钟,
最后用12 mL甲醇和较强的负压洗涤柱子至干后至少10分钟。
9.22.4 在举办9.22.3步的操纵时代,将乙酸乙酯和氢氧化铵殽杂溶液(6.3.5)放在一个超声波水浴中殽杂匀称待用。
9.22.5 用12 mL上一步殽杂匀称的乙酸乙酯和氢氧化铵殽杂溶液,洗脱柱子上的待说明因素。
9.23 通氮气在温度为40 5℃的加热块上蒸发洗脱液。
9.24 插手200 L甲醇,强烈涡流动摇,消融蒸发残渣。
9.25 将溶液转移至一个回响玻璃小瓶中。
9.26 再用100 L甲醇消融上一步未消融完全的残渣,溶液归并进回响玻璃小瓶中。
9.27 在温度为40 5℃的加热块上蒸发甲醇至干。
9.28 衍生化回响。
9.28.1 插手50 L的N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA),并强烈涡流动摇。
9.28.2 将回响小瓶安排在75 5℃ 的加热块上安排90 15分钟。
9.28.3 将回响小瓶转移至一个温度为40 5℃ 的加热块上,让小瓶和加热块冷却到室温(25℃)后,通氮气流蒸发至干。
9.28.4 插手25 L甲苯(6.2.10)强烈涡流动摇消融蒸发残渣。
9.28.5 小瓶可以贮存于温度为 +4 ℃的冰箱内。
9.29 打针2 L上一步操纵中的溶液进入GC-MS。
9.30 GC-MS仪器说明体系。
GC-MS仪器说明体系以选择性离子监督运行, -感动剂衍生物的保存时刻罗列在7.14.2的表1中。

10 对功效的说明
10.1 说明功效的正当性;欧共体第256号决策中关于功效的尺度表述都应该做到,尤其是对下列内容。
10.1.1 在恰当基质中尺度被说明物的三甲基硅烷衍生物,与被猜疑的响应的 -感动剂的三甲基硅烷衍生物,它们的相对保存时刻,必需是沟通的。
10.1.2 被选择离子对基峰的相对品貌,与空缺肝、肾和肉样中添加的尺度物的响应离子对基峰的相对品貌,必需是沟通的。
10.1.3 内标尺度物的离子(metoprolol-单体三甲基硅烷衍生物离子),必需呈此刻正确的相对保存时刻的位置上。
10.1.4 添加有内标尺度物的空缺肝、肾和肉样的说明功效,必需确保没有来自GC-MS体系中残留 -感动剂的任何孝顺,即 -感动剂的含量不能高出添加量。这也是对体系是否有污染的一种查核。

11 非凡事例

12 要领留意点

13 质量节制
参看关于 -感动剂的RMs具体手册的第8节的内容。

14 检讨陈诉

15 缩略语列表
一分全面的缩略语列表放在附件I的第12节。

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16 尝试流程图

肝,肾,肉样品 (均质) ——————→ 高氯酸沉淀 ——————→ 提取

1.溶剂液液分派萃取
2. 固相提取柱色谱

计较功效 ←——— GC-MS ←——— 三甲基硅烷化衍生


作者:admin 来源:网络收集 发布时间:2016年02月13日